哈維氏弧菌感染對(duì)紅鰭東方鲀IL-6基因DNA甲基化的影響

王晨詩(shī)，黃馨笛，崔曉玉，倪萍，葉仕根，王華，高東旭*，雷威

(1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 大連市海珍品疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；2.國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，遼寧 大連 116023)

紅鰭東方鲀Takifugurubripes是廣泛分布于中國(guó)、日本、韓國(guó)等沿海地區(qū)的重要海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚(yú)類[1]。近年來(lái)，在紅鰭東方鲀的養(yǎng)殖過(guò)程中常大規(guī)模暴發(fā)細(xì)菌性疾病[2]，其中由哈維氏弧菌Vibrioharveyi引起的病害問(wèn)題較為嚴(yán)重[3]。哈維氏弧菌是海水中常見(jiàn)的條件致病菌，可感染海水魚(yú)類、甲殼類等生物，感染后病魚(yú)表現(xiàn)為游動(dòng)緩慢，停止攝食，體表不同程度潰爛，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死亡[4]。目前，紅鰭東方鲀?cè)诟腥竟S氏弧菌后尚無(wú)有效的藥物進(jìn)行治療，因此，通過(guò)研究紅鰭東方鲀自身免疫器官和免疫相關(guān)基因在抵御哈維氏弧菌感染過(guò)程中發(fā)揮的作用來(lái)尋找新的解決方法意義重大。

脾臟是魚(yú)類重要的免疫器官之一，可參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答過(guò)程，如產(chǎn)生含抗體的細(xì)胞及免疫球蛋白、參與抗原處理等[5]。魚(yú)類白細(xì)胞介素(interleukin)是由魚(yú)體白細(xì)胞或免疫細(xì)胞受抗原刺激后產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子[6]，研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素-6(IL-6)在紅鰭東方鲀體內(nèi)存在較為廣泛，其在傳遞信息、激活或調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞等方面發(fā)揮重要作用[7-8]。本研究團(tuán)隊(duì)前期的轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序數(shù)據(jù)表明，紅鰭東方鲀感染哈維氏弧菌后脾臟中IL-6基因表達(dá)水平存在顯著性差異，結(jié)合差異基因功能富集等分析結(jié)果，將IL-6基因選為重點(diǎn)關(guān)注的候選基因之一(未發(fā)表數(shù)據(jù))。

DNA甲基化是在不改變DNA遺傳序列的基礎(chǔ)上，僅對(duì)DNA進(jìn)行修飾來(lái)調(diào)控基因表達(dá)的生化過(guò)程。甲基的加入通常發(fā)生在基因的啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)，鄰近鳥(niǎo)苷酸的胞嘧啶殘基(CpG 位點(diǎn))位置，成串的CpG位點(diǎn)稱為CpG島[9]。研究發(fā)現(xiàn)，許多疾病的發(fā)生發(fā)展與DNA甲基化調(diào)控相關(guān)[10]。如細(xì)菌感染后會(huì)引起宿主發(fā)生全基因組和關(guān)鍵免疫調(diào)控基因DNA甲基化狀態(tài)改變[11-12]。因此，DNA甲基化的調(diào)控在動(dòng)物抗病育種中發(fā)揮著重要作用[13-15]。目前，關(guān)于紅鰭東方鲀感染哈維氏弧菌后其重要免疫調(diào)控基因的DNA甲基化變化情況尚無(wú)報(bào)道。本研究中，針對(duì)紅鰭東方鲀感染哈維氏弧菌后脾臟中IL-6基因DNA甲基化狀態(tài)的改變展開(kāi)研究，以期為紅鰭東方鲀哈維氏弧菌病的發(fā)病機(jī)理研究提供參考，也為紅鰭東方鲀抗病育種工作提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用紅鰭東方鲀購(gòu)自大連天正實(shí)業(yè)有限公司，體質(zhì)量為(100.5±10.8)g，在水溫18～20 ℃條件下暫養(yǎng)一周。哈維氏弧菌為大連市海珍品疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌庫(kù)保存的菌株。

1.2 方法

1.2.1 哈維氏弧菌菌液的制備 將活化后的哈維氏弧菌接種在胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)上，于28 ℃培養(yǎng)12 h，挑取菌落接種于200 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)液(TSB)中，放入轉(zhuǎn)速為180 r/min、28 ℃的搖床中培養(yǎng)4～6 h。然后在-4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，棄上清，用生理鹽水稀釋沉淀，采用平板計(jì)數(shù)法制備成1×107cfu/mL菌液待用。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集 試驗(yàn)分為對(duì)照組和浸泡感染組，每組各30尾紅鰭東方鲀。浸泡菌液濃度為107cfu/mL，感染組魚(yú)在菌液中浸泡12 h后轉(zhuǎn)移到無(wú)致病性病原的干凈海水中繼續(xù)飼養(yǎng)7 d，而對(duì)照組魚(yú)整個(gè)試驗(yàn)期間均在無(wú)致病性病原的干凈海水中飼養(yǎng)。試驗(yàn)期間各組飼養(yǎng)條件不變，每隔2 d換水1/3，保持飼養(yǎng)水質(zhì)優(yōu)良。

于試驗(yàn)第7天時(shí)進(jìn)行樣品采集。用麻醉劑三卡因甲基磺酸鹽(MS222 200 mg/L，Sigma)對(duì)魚(yú)進(jìn)行麻醉，觀察記錄紅鰭東方鲀外觀及內(nèi)臟器官變化情況，采集脾臟分別進(jìn)行多聚甲醛固定和液氮冷凍保存，以用于后續(xù)制作石蠟切片和相關(guān)分子試驗(yàn)。

根據(jù)攻毒后紅鰭東方鲀?cè)谟蝿?dòng)狀態(tài)、活力表現(xiàn)和脾臟病變情況等方面表現(xiàn)出的差異，將攻毒后的紅鰭東方鲀劃分為發(fā)病組和未發(fā)病組，其中發(fā)病組表現(xiàn)為游動(dòng)緩慢或漂游、觸碰反應(yīng)慢、活力差、脾臟壞死，未發(fā)病組各方面表現(xiàn)出與對(duì)照組相似狀態(tài)，游動(dòng)情況正常、觸碰反應(yīng)快、活力好、脾臟無(wú)壞死。

1.2.3 石蠟切片的制作 采用常規(guī)石蠟切片法開(kāi)展脾臟組織學(xué)研究。取出固定好的脾臟，經(jīng)梯度乙醇(70%～100%，均為體積分?jǐn)?shù))脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成石蠟切片(厚5 μm)，經(jīng)H.E染色后在顯微鏡(LEICA DM 4000B LED)下觀察并拍照。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR) 以β-actin為內(nèi)參基因、IL-6為目的基因，利用Prmier 5.0設(shè)計(jì)引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，qPCR試驗(yàn)按照莫納生物技術(shù)有限公司的Mon AmpTMChemo HS qPCR Mix(High Rox)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作[16]。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：10～20 ng/μL cDNA模板1 μL，0.2 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，Mon AmpTMChemo HS qPCR Mix(High Rox)10 μL，去離子水8 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃下預(yù)變性5 min；95 ℃下變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃下延伸30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析：95 ℃反應(yīng)15 s，60 ℃反應(yīng)1 min，95 ℃反應(yīng)15 s。每組樣品設(shè)置4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.2.5 DNA甲基化檢測(cè) 采用北京全式金生物公司EasyPure?Marine Animal Genomic DNA Kit說(shuō)明書提取基因組DNA，提取后的DNA送生工生物工程(上海)股份有限公司，利用亞硫酸氫鹽測(cè)序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)檢測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化情況?；蚪MDNA按照EZ DNA Methylation-Gold試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后，利用UCSC網(wǎng)站(https://genome.ucsc.edu/)查找IL-6基因啟動(dòng)子區(qū)域，利用Meth Primer在線軟件(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域CpG島并設(shè)計(jì)IL-6基因的BSP引物(F: 5′CAAATACCAATCTACACTAATCTAATCT 3′；R: 5′ACTAACCTTTAAAATAACTATTACAACAC 3′)。后續(xù)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系(50 μL)：20～50 ng/μL DNA模板2 μL，10 μmol/L上、下游引物各2 μL，10 μmol/L dNTP(mix)3 μL，10×Taq Buffer(with MgCl2)5 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL，去離子水35.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下變性30 s，55 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸50 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下修復(fù)延伸8 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序檢測(cè)CpG位點(diǎn)甲基化情況，每組樣品進(jìn)行10個(gè)克隆。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±S.E.)表示，用SPSS Statistics 24.0軟件對(duì)目的基因的相對(duì)表達(dá)量和DNA甲基化率進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織病理變化

紅鰭東方鲀脾臟組織切片如圖1所示，相較于對(duì)照組(圖1A)，發(fā)病組出現(xiàn)大量的壞死病灶，表現(xiàn)為細(xì)胞之間空隙增大(圖1B)，未發(fā)病組無(wú)明顯病變(圖1C)。

A—對(duì)照組；B—發(fā)病組；C—未發(fā)病組；箭頭示壞死區(qū)域。

2.2 IL-6基因相對(duì)表達(dá)量變化

IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量變化如圖2所示，發(fā)病組IL-6表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組和未發(fā)病組(P<0.05)，未發(fā)病組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，下同。

2.3 IL-6基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化變化

因發(fā)病組IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和未發(fā)病組，而未發(fā)病組與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，故進(jìn)一步檢測(cè)IL-6基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化情況，探索其表達(dá)量差異是否與啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化水平變化有關(guān)。甲基化檢測(cè)結(jié)果顯示，在IL-6基因啟動(dòng)子(轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp)區(qū)域1 815～1 941 bp的位置有一個(gè)127 bp 的CpG島(GC含量>40.0%, Obs/Exp>0.6)(圖3(a))。引物擴(kuò)增區(qū)域(1 715～1 948 bp)序列中共有12個(gè)CpG位點(diǎn)(圖3(b))。

圖3 IL-6基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島和引物擴(kuò)增序列

未發(fā)病組IL-6基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化水平與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)，但顯著高于發(fā)病組(P<0.05)(圖4(a))，具體甲基化位點(diǎn)改變?nèi)鐖D4(b)～(d)所示。

●代表CpG位點(diǎn)發(fā)生甲基化，○代表CpG位點(diǎn)未發(fā)生甲基化。

3 討論

3.1 感染弧菌后魚(yú)體脾臟的組織病理變化

本研究中紅鰭東方鲀感染哈維氏弧菌后，發(fā)病組脾臟出現(xiàn)嚴(yán)重的壞死現(xiàn)象，未發(fā)病組則無(wú)明顯損傷。從病理切片上看，未發(fā)病組與對(duì)照組細(xì)胞顏色有所差異，這主要是由于染色的批次時(shí)間不同造成的；與對(duì)照組相比，未發(fā)病組細(xì)胞排列緊密、完整，無(wú)組織間隙增大的壞死現(xiàn)象，故認(rèn)為未發(fā)病組的脾臟沒(méi)有受到破壞。細(xì)菌感染魚(yú)類通常會(huì)導(dǎo)致其脾臟壞死[17-18]，蔣自立等[18]研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila感染黃顙魚(yú)Pelteobagrusfulvidraco后，其脾臟中也出現(xiàn)組織壞死現(xiàn)象，這與本研究結(jié)果類似。魚(yú)類脾臟是紅細(xì)胞及各種粒細(xì)胞產(chǎn)生、儲(chǔ)存和成熟的場(chǎng)所，既是重要的免疫器官，也是重要的造血系統(tǒng)[5,19]。徐曉津等[17]研究發(fā)現(xiàn)，大黃魚(yú)Larimichthyscrocea感染哈維氏弧菌后，其脾臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞遭到破壞，造血功能衰竭，而造血功能受到影響會(huì)加劇魚(yú)體自身免疫力和抗病能力的下降，進(jìn)而加速魚(yú)體死亡[19]。此外，脾臟組織壞死也可能影響淋巴細(xì)胞的成熟和分化，從而影響機(jī)體細(xì)胞和體液免疫過(guò)程，進(jìn)而對(duì)魚(yú)體的整個(gè)免疫功能造成影響[20]。本研究中，被哈維氏弧菌感染的紅鰭東方鲀個(gè)體由于自身免疫能力的不同，導(dǎo)致有的個(gè)體脾臟出現(xiàn)壞死，而有的個(gè)體無(wú)明顯損傷。

3.2 感染弧菌后魚(yú)體脾臟IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化

IL-6因子主要作用于多種淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及其他細(xì)胞，參與調(diào)控機(jī)體的免疫反應(yīng)[21]。本研究表明，當(dāng)哈維氏弧菌感染魚(yú)體后，可刺激發(fā)病組魚(yú)體內(nèi)IL-6基因的高表達(dá)，原因是，在正常機(jī)體內(nèi)IL-6基因相對(duì)表達(dá)量很低，但當(dāng)機(jī)體受到外源因子刺激后可在短時(shí)間內(nèi)大量表達(dá)IL-6基因[22]。同時(shí)，IL-6作為一種炎癥因子，參與并調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過(guò)程。研究表明，在哺乳動(dòng)物和魚(yú)類中IL-6表達(dá)量升高能夠上調(diào)一些促炎癥細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素1β、腫瘤壞死因子α)的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)[23-24]，嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)則可導(dǎo)致組織出現(xiàn)壞死的病理變化[25]。本研究中哈維氏弧菌感染后，發(fā)病組脾臟出現(xiàn)大量壞死病灶，由此推測(cè)，這可能與IL-6基因表達(dá)量升高進(jìn)而促進(jìn)脾臟中的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

3.3 DNA甲基化對(duì)IL-6 mRNA表達(dá)的影響

DNA甲基化的改變?cè)隰~(yú)類自身的抗病過(guò)程中發(fā)揮著直接或間接的作用[13-14]。草魚(yú)Ctenopharyngodonidella抗病毒基因維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ在出血病抗病個(gè)體和易感個(gè)體間DNA甲基化水平具有顯著性差異[14]。在家禽中也有類似研究，在雞禽流感感染組和未感染組的脾臟中全基因組甲基化率具有顯著差異[15]。DNA甲基化是一種常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)修飾，對(duì)于正?；虻谋磉_(dá)調(diào)控是必需的，與基因表達(dá)異常、DNA損傷修復(fù)、基因組不穩(wěn)定性和遺傳性狀的改變密切相關(guān)；甲基的加入特別是發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū)域，會(huì)抑制基因的表達(dá)，相反，甲基的移除則可能激活和加強(qiáng)基因的表達(dá)[26-27]。受苯并芘暴露的影響，斑馬魚(yú)Daniorerio腦中鋅指結(jié)構(gòu)c4h2基因(zc4h2)的DNA甲基化水平降低，并誘導(dǎo)zc4h2 mRNA高表達(dá)[28]。本研究中，未發(fā)病組IL-6基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化水平顯著高于發(fā)病組，而相對(duì)應(yīng)的未發(fā)病組IL-6 mRNA表達(dá)則顯著低于發(fā)病組。

目前，關(guān)于魚(yú)類的DNA甲基化研究已廣泛開(kāi)展，但主要集中在生態(tài)毒理和遺傳育種等方面[29-30]，關(guān)于DNA甲基化與經(jīng)濟(jì)魚(yú)類疾病相關(guān)的研究報(bào)道較少。本研究中，從表觀遺傳水平初步揭示哈維氏弧菌感染后發(fā)病組和未發(fā)病組脾臟中IL-6基因相對(duì)表達(dá)量的差異可能與其啟動(dòng)子區(qū)域差異DNA甲基化相關(guān)，這為今后紅鰭東方鲀抗病育種工作提供了新思路。

4 結(jié)論

1)紅鰭東方鲀個(gè)體對(duì)哈維氏弧菌感染表現(xiàn)出不同的抗病能力，發(fā)病組脾臟出現(xiàn)大量壞死灶，而未發(fā)病組脾臟未出現(xiàn)壞死現(xiàn)象。

2)抗病能力不同的紅鰭東方鲀IL-6 mRNA表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化水平存在明顯差異，未發(fā)病組IL-6基因DNA甲基化水平顯著高于發(fā)病組，而mRNA表達(dá)則顯著低于發(fā)病組。本試驗(yàn)結(jié)果為探討紅鰭東方鲀哈維氏弧菌病的發(fā)病機(jī)制以及分子水平抗病育種提供了新思路。