非洲鴕鳥糞便中大腸桿菌的分離與鑒定

徐東杰，王家鄉(xiāng)，李 鵬，謝 洋，皮勁松，吳 艷

（1.長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025；2.湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430064）

非洲鴕鳥（Struthio camelus），屬鴕形目鴕鳥科鳥類，是目前現存鳥類中體型最大的、惟一的二趾鳥類，原生活于阿拉伯沙漠和非洲稀樹林地帶、沙漠草地［1，2］。鴕鳥全身都是寶，鴕鳥肉中蛋白質、鈣、鐵和鋅的含量遠比牛肉高［3］，具有特別高的經濟價值［4］。鴕鳥的皮美觀柔軟、舒服耐用、透氣性能好，是目前世界上鴕鳥養(yǎng)殖的重要產品［5］。鴕鳥皮加工后也可用于中高檔服飾產業(yè)［6］。鴕鳥蛋用途多，不僅能夠食用［7］，還能夠做成裝飾品［8］。

大腸桿菌為兩端鈍圓的革蘭氏陰性短桿菌，大多數大腸桿菌有鞭毛，可以運動，無莢膜、無芽孢。大腸桿菌是引起禽類患病最常見的病原菌［9］。根據致病特點可將致腸道疾病的大腸桿菌分為6類：腸產毒性大腸桿菌（ETEC）、腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）、腸黏附性大腸桿菌（EAEC）和彌散黏附性大腸桿菌（DAEC）［10］。從流行病學上來說，大腸桿菌具有流行范圍廣、傳播速度快等特點，可引起禽類全身各種疾病。該細菌既能水平傳播也能垂直傳播，水平傳播可通過消化道、呼吸道、交配等途徑，垂直傳播則是通過種蛋污染［11］。從臨床診斷學來看，致病性大腸桿菌主要臨床表現為全身性的急性敗血癥、氣囊病、卵黃性腹膜炎、輸卵管炎、腸炎等多種癥狀。單獨感染致病性大腸桿菌時根據致病菌的毒力大小、禽本身健康狀態(tài)，發(fā)病率、死亡率都有所差別，毒力強則發(fā)病率、死亡率高［12］。從病理學上來說，通常感染大腸桿菌病后實質器官會有出血點并變腫，肝臟顏色轉為土黃色或綠色，同時伴有腹膜炎、腸炎等各種炎癥。大腸桿菌可與其他病原菌混合感染而加重病情，致使禽大腸桿菌病不能得到有效防控，給禽養(yǎng)殖產業(yè)造成了嚴重的經濟損失［13］。

本研究通過微生物鑒定方法從鴕鳥糞便中分離出大腸桿菌菌株并進行鏡檢，將分離9株大腸桿菌與其他文獻中致病性大腸桿菌的生化特性對比，利用生化特性鑒定大腸桿菌，對大腸桿菌病原學分類研究具有一定參考價值，為下一步研討大腸桿菌生物學特性奠定好前期基礎，為尋找致病性大腸桿菌做準備，為大腸桿菌疾病的診斷、醫(yī)治提供理論依據，以減少養(yǎng)禽業(yè)的經濟損失。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣本采集長江大學鴕鳥研究所中9羽（5只雌性、4只雄性）日齡、體況相近的非洲鴕鳥的糞便作為研究對象。

1.1.2 試劑與儀器恒溫振蕩培養(yǎng)箱、酒精燈，常州億通分析儀器制造有限公司；光學顯微鏡BH-2，日本奧林巴斯公司；移液槍、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、載玻片，江蘇順和教學儀器有限公司；低溫冰箱，海爾集團；電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；手提式壓力滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海博尋實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；瓊脂、葡萄糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、鼠李糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露醇、明膠、山梨醇、尿素、吲哚、枸櫞酸鹽、硫化氫、VP、MR，AR級，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 主要溶液和培養(yǎng)基

1）麥康凱瓊脂配制。將17 g蛋白胨、3 g?胨、5 g膽鹽和5 g氯化鈉溶解于400 mL去離子水中，pH 7.2。將17 g瓊脂加入600 mL去離子水中，使其加熱并熔解。將2種液體混合，分裝瓶內，并121℃高壓滅菌15 min，冷卻后備用。當需要使用時，需先加熱熔化瓊脂，加入10 g乳糖，冷卻至50℃左右時，加入10 mL結晶紫水溶液和0.5%中性紅水溶液5 mL，搖勻后傾注平板。

2）糖發(fā)酵管配制。用電子天平稱取5 g牛肉膏、10 g蛋白胨、2g磷酸氫二鈉、3 g氯化鈉，將稱取物與12 mL 0.2%滇麝香草酚藍溶液置于1 000 mL的錐形瓶，定容，pH 7.4，按0.5%加入葡萄糖，分裝至小試管內，121℃高壓滅菌15 min。其他糖類發(fā)酵管均可按上述成分配好后分裝每瓶100 mL，121℃高壓滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集利用滅菌后的牙簽和平皿收集新鮮糞便，取9只鴕鳥的糞便后分別用標簽標記1～9。稱重：稱取1 g糞便；分裝：浸入裝有無菌水的試管；稀釋：將試管底部利用振蕩機振蕩5 min；沉淀：將試管分別插入試管架，靜置5 min；備用：用吸管取上清液分裝到無菌試管。

1.2.2 細菌的分離培養(yǎng)在超凈工作臺上，將疑似有大腸桿菌的菌液劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱內37℃培養(yǎng)24 h，挑取紅色或粉紅色的菌落繼續(xù)在麥康凱培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，重復3～5次，得到純培養(yǎng)后的大腸桿菌菌落，并觀察其生長形態(tài)。

1.2.3 糖酵解試驗制作葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、鼠李糖、棉子糖等鑒定大腸桿菌所需的生化鑒定管，用接種針在酒精燈上灼燒后挑取純化后的單個菌落接種，接種后用塞子封住管口，并放入恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄每根生化鑒定管發(fā)酵結果。

1.2.4 吲哚試驗挑取麥康凱培養(yǎng)基上生長的單個菌落培養(yǎng)在鄧亨氏蛋白胨水溶液中，置于恒溫箱中37℃培養(yǎng)24～48 h，培養(yǎng)完成后于培養(yǎng)液中加入2～3 mL二甲苯溶液，搖勻后靜置3 min，加入2 mL Ehrlich試劑，5 min后觀察溶液顏色。

1.2.5 VP試驗將被檢菌接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置于恒溫箱中37℃培養(yǎng)48～72 h、培養(yǎng)液2.5 mL先加入5℃α萘酚（2-na-phthol）純乙醇溶液0.6 mL，再加40%氫氧化鉀水溶液0.2 mL，搖動2～5 min，室溫靜置或36℃恒溫箱10 min后觀察溶液顏色。

1.2.6 MR試驗將被檢菌接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置于恒溫箱中37℃培養(yǎng)48 h，取出后加入甲基紅試劑2～5滴，觀察溶液顏色變化情況。

1.2.7 枸櫞酸鹽試驗將被檢菌接種并劃線于枸櫞酸鈉瓊脂斜面，置于恒溫箱中37℃培養(yǎng)48 h，觀察菌生長情況或培養(yǎng)基顏色。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離與純化

從表1可以看出，2、4、7、9號稀糞分離出菌株比3、5、6、8號干糞分離出的菌株生長顏色更鮮艷、菌落直徑更大，且1號菌株與其他稀糞分離出的菌株顏色不同呈灰白色。2～9號菌株大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，純培養(yǎng)3次后生長肉眼可見為圓形、濕潤、邊緣整齊、紅色的點狀菌落，從1號干糞分離出的菌株接種在麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，菌落顏色為白色、透明、濕潤的圓形菌落，除顏色外形態(tài)特征均與典型大腸桿菌菌落相似，且3次純培養(yǎng)生長后依舊為白色菌落（圖1）。9株細菌革蘭氏染色后均為陰性，均為大小不一、兩端鈍圓的短小桿菌（圖2），9株菌株初步鑒定為大腸桿菌［14］。

表1 樣品菌在麥康凱培養(yǎng)基前3次純培養(yǎng)生長情況

圖1 細菌在麥康凱培養(yǎng)基上的生長情況

圖2 革蘭染色鏡檢結果（1 000×）

2.2 生化鑒定

從表2可以看出，9株分離菌株均能發(fā)酵葡萄糖、甘露醇、阿拉伯糖、山梨醇、麥芽糖、鼠李糖，6株菌株能分解蔗糖、棉子糖，所有菌株均不能利用枸櫞酸鹽，所有菌株VP試驗均為陰性，所有菌株MR試驗和吲哚試驗均為陽性。從表3可以看出，1號稀糞的菌株不能發(fā)酵乳糖，2、4、7、9號稀糞分離出的菌株發(fā)酵乳糖速度遲緩，3、5、6、8號干糞分離的菌發(fā)酵乳糖速度迅速［15，16］。大腸桿菌分解乳糖主要依賴于β-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶透性酶。當兩種酶同時存在，大腸桿菌才能分解乳糖，而出現遲發(fā)酵或不發(fā)酵乳糖的情況則可能是缺乏其中任何一種酶［17］，9株被檢菌株均為大腸桿菌［18，19］。

表2 大腸桿菌生化鑒定結果

表3 大腸桿菌乳糖發(fā)酵情況

3 小結與討論

鴕鳥作為目前世界上最大的走禽，其生長迅速、繁殖力強、抗病性強，具有較高的經濟價值。目前，中國已有很多人工飼養(yǎng)的鴕鳥養(yǎng)殖場，但對鴕鳥的疾病與防治相關的研究并不全面。

大腸桿菌是引起禽類疾病的最常見的病原菌。作為腸道內常在菌，致病性大腸桿菌會對寄主造成損害，對寄主的存活、生長及發(fā)育產生重大影響。大腸桿菌為兩端鈍圓的革蘭氏陰性短桿菌，有鞭毛，可運動，無莢膜、無芽孢。大腸桿菌能夠分解蔗糖、麥芽糖、鼠李糖、葡萄糖等碳水化合物。大腸桿菌菌株能快速發(fā)酵乳糖，但也有少數菌株不發(fā)酵或延遲發(fā)酵乳糖［17］。

本試驗以非洲鴕鳥糞便為研究對象，對分離、鑒定出的大腸桿菌進行培養(yǎng)，并與其他禽類大腸桿菌的形態(tài)特征對比。通過革蘭氏染色以及顯微鏡下的形態(tài)學觀察，為兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌，初步確定為大腸桿菌，而后通過生化鑒定，確定了所分離的菌株為大腸桿菌。本試驗中從1號稀糞中分離的菌株對乳糖不發(fā)酵，因此在鑒定大腸桿菌時要考慮到不發(fā)酵或發(fā)酵遲緩的菌株存在的可能性，避免因考慮生化特性不全面而引起實驗室診斷的誤診［20］，這種菌仍可能存在致病能力，應重視遲發(fā)酵或不發(fā)酵乳糖型大腸桿菌的研究。