酶聯(lián)免疫吸附法和免疫親和柱-高效液相色譜法在檢測(cè)飼料中黃曲霉毒素B1含量中的比對(duì)研究

段春宇

摘要： 為了探討酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)飼料中黃曲霉毒素B1含量的可行性，試驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）比對(duì)免疫親和柱-高效液相色譜法（IAC-HPLC法），對(duì)飼料中黃曲霉毒素B1含量進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度、精密度和樣品加標(biāo)回收率進(jìn)行了分析。ELISA法線性方程相關(guān)系數(shù)為0.9952，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.6%～8.1%，平均加標(biāo)回收率為105.6%～111.8%。結(jié)果表明，ELISA法的準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好;且ELISA法檢測(cè)結(jié)果與IAC-HPLC法檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5.4%～19.2%，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果的偏差可以接受，表明ELISA法能滿(mǎn)足檢測(cè)需求。

關(guān)鍵詞：酶聯(lián)免疫吸附法;免疫親和柱-高效液相色譜法;飼料;黃曲霉毒素B1

黃曲霉毒素，是黃曲霉菌和寄生曲霉菌分泌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要分為B、G類(lèi)，其中黃曲霉毒素B1的含量最多，危害性最大，該毒素具有強(qiáng)致癌性、致畸性、致突變性。黃曲霉毒素B1可以侵害畜禽肝臟，導(dǎo)致肝臟變性、壞死等，進(jìn)而導(dǎo)致畜禽肺臟、腎臟、脾臟、胃、直腸等器官發(fā)生病變;導(dǎo)致畜禽的免疫力降低;導(dǎo)致畜禽生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，采食量降低、食物利用率低;母畜不育或產(chǎn)仔少等問(wèn)題。

黃曲霉毒素B1主要污染糧食作物及其副產(chǎn)品，其中，花生和玉米及其副產(chǎn)品污染最為嚴(yán)重，幾乎無(wú)法避免，該毒素性質(zhì)穩(wěn)定，持續(xù)高壓滅菌2h僅能降低其25%～33%的毒力，而且只有在282℃的高溫下才能被裂解，所以世界各國(guó)都嚴(yán)格設(shè)定“限量標(biāo)準(zhǔn)”。黃曲霉毒素B1污染飼料主要源于原料污染、儲(chǔ)存條件不當(dāng)飼料霉變污染和加工過(guò)程污染。要預(yù)防黃曲霉毒素B1毒害畜禽，就要及時(shí)準(zhǔn)確測(cè)定飼料原料及飼料成品中黃曲霉毒素B1含量，因而制定準(zhǔn)確實(shí)用的檢測(cè)方案至關(guān)重要，進(jìn)而加強(qiáng)原料的篩選、飼料的品控，更好的保護(hù)畜禽健康，發(fā)揮畜禽生產(chǎn)性能，將飼料價(jià)值充分發(fā)揮。

飼料中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)方法較多，有薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條等，本文采用免疫親和柱-高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)飼料原料和成品中黃曲霉毒素B1的含量，并通過(guò)比對(duì)分析，確定ELISA法檢測(cè)飼料中黃曲霉毒素B1含量的可行性。

2 免疫親和柱-高效液相色譜法材料與方法

2.1 試劑與耗材

甲醇（色譜純，默克公司）、黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）、黃曲霉毒素免疫親和柱（ROMER公司）、氯化鈉（分析純）、玻璃纖維濾紙等。

2.2 主要儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀配熒光檢測(cè)器、光化學(xué)衍生器、高速萬(wàn)能粉碎機(jī)、高速混勻器、固相萃取儀等。

2.3 方法

1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司），原液濃度為20μg/mL，用甲醇溶液逐級(jí)稀釋成100ng/mL的工作液。再用流動(dòng)相分別稀釋成0.10、0.50、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2）樣品前處理 試樣制備參照GB/T 20195—2006，用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)研磨后過(guò)1mm孔篩，混勻，儲(chǔ)存于封閉容器，避光低溫保存，待檢。稱(chēng)取50.0g待檢樣品于250mL具塞錐形瓶中，加入5g氯化鈉和125.0mL的甲醇水（70+30）溶液混勻，振蕩器200rpm/min震蕩30min，定量濾紙過(guò)濾后，準(zhǔn)確移取10.0mL濾液，加入20.0mL超純水稀釋混勻，玻璃纖維濾紙過(guò)濾，至濾液澄清，收集濾液于干凈離心管中做上樣液。

將免疫親和柱連接于10.0mL的玻璃定量管下，取15.0mL上樣液，過(guò)免疫親和柱，流速1～2drop/s;待柱內(nèi)液體排干后，分別兩次用10.0mL超純水清洗柱子，流速2～3drop/s;待柱內(nèi)液體全部排干后，增大泵壓，抽干免疫親和柱內(nèi)液體，用1.0mL甲醇洗脫柱子，流速自然重力，直至2～3mL空氣通過(guò)柱子，收集全部洗脫液于玻璃定量管中，加超純水定容為2.0mL。定容后的洗脫液用0.22μm的有機(jī)微孔過(guò)濾器過(guò)濾到樣品瓶中，待檢。

3）色譜條件 色譜柱：Agilent C18色譜柱（規(guī)格：150×4.6mm，粒度5μm）;流動(dòng)相：超純水+甲醇+乙腈（60+20+20）等度洗脫;流速：1.0mL/min;FLD波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)440nm;柱溫40℃;進(jìn)樣量：50μL。

采用外標(biāo)法，根據(jù)樣品峰保留時(shí)間進(jìn)行定性，峰面積進(jìn)行定量分析。

3 酶聯(lián)免疫吸附法材料與方法

3.1 試劑與耗材

黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫試劑盒（ROMER公司）、超純水、針式過(guò)濾器。

3.2 主要儀器

酶標(biāo)測(cè)定儀：內(nèi)置450nm濾光片、回旋振蕩器、渦旋振蕩器、微量移液器等。

3.3 方法

1）樣品前處理 稱(chēng)取20.0g樣品于250mL具塞錐形瓶中，加入100.0mL甲醇水（70+30）溶液提取，置于回旋振蕩器上震蕩萃取3min，靜置樣品，定性濾紙過(guò)濾。用1mol/L的NaOH和HCl微調(diào)濾液pH 6～8，如果樣品酸性比較強(qiáng)，可以使用高濃度的酸堿進(jìn)行調(diào)節(jié)，盡量減少酸堿的用量。用試劑盒提供分析緩沖液1：1稀釋濾液，于1mL離心管中，用渦旋振蕩器混勻，待測(cè)。

2）試劑盒操作過(guò)程 實(shí)驗(yàn)室溫度控制在20～25℃，從冰箱中拿出試劑盒，取出試劑盒中所有試劑回溫2～3h;用八道移液器取（綠色瓶蓋）酶聯(lián)偶合物200μL，放入綠色預(yù)混合板中;單道移液器分別取100μL各濃度標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，放入以上預(yù)混合板中，用八道移液器混合四次（注意溶液不要溢出，防止各孔污染）;將孔板進(jìn)行編號(hào)，以便記錄標(biāo)準(zhǔn)品、樣品位置，用八道移液器將上述混合液100μL轉(zhuǎn)移至抗體包被的孔中，室溫避光孵育15min，轉(zhuǎn)移過(guò)程中不要有氣泡;蒸餾水清洗4次拍干（清洗時(shí)各孔不要相互污染），用洗瓶沖洗時(shí)，不要直接沖洗孔，側(cè)著清洗，防止底部的物質(zhì)沖出，清洗后輕甩一下，在吸水紙上快速拍干孔板，不要大幅度用手甩板，孔板中沒(méi)有液滴即可;拍干后，用八道移液器每孔加入（藍(lán)色瓶蓋）底物100μL;室溫光孵育5min;時(shí)間到后，用八道移液器每孔加入（紅色瓶蓋）終止液100μL，輕輕搖勻后檢測(cè);將孔板轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)儀450nm（帶630nm示差波長(zhǎng)）讀取每孔的吸光度值。

4 結(jié)果與分析

4.1 結(jié)果

本研究選用空白玉米進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，樣品名稱(chēng)加標(biāo)1、加標(biāo)2和加標(biāo)3，黃曲霉毒素B1添加濃度分別為10.0、20.0和50.0μg/kg，選取花生粕、玉米胚芽粕、奶牛配合飼料樣品各一個(gè)，分別用IAC-HPLC法和ELISA法各重復(fù)3次試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表1。

1）免疫親和柱-高效液相色譜法的工作曲線、準(zhǔn)確度、精密度 標(biāo)準(zhǔn)系列經(jīng)上機(jī)檢測(cè)，以測(cè)得峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，得到黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積（Y）的線性方程Y=10.00282X-1.71180，相關(guān)系數(shù)為0.99976，表明在0.10 ～50.0ng/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。加標(biāo)回收試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)是驗(yàn)證方法準(zhǔn)確度和精密度的重要手段。按上述IAC-HPLC法試驗(yàn)方法，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。本結(jié)果的平均加標(biāo)回收率為93.0%～99.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.8%～4.8%。說(shuō)明此方法準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好。黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖及待檢樣品色譜圖分別見(jiàn)圖1和圖2。

2）酶聯(lián)免疫吸附法的準(zhǔn)確度、精密度 試劑盒標(biāo)準(zhǔn)系列經(jīng)上機(jī)檢測(cè)，在ROMER公司提供計(jì)算軟件上計(jì)算結(jié)果，線性方程相關(guān)系數(shù)為0.9952，表明在0.10 ～50.0ng/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。按上述ELISA法試驗(yàn)方法，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。本結(jié)果的平均加標(biāo)回收率為105.6%～111.8%，RSD為1.6%～8.1%。ELISA法的準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性可以接受。ELISA法檢測(cè)結(jié)果與IAC-HPLC法檢測(cè)結(jié)果的RSD為5.4%～19.2%，兩種方法結(jié)果的偏差表明ELISA法準(zhǔn)確度可以接受。

4.2 分析

使用IAC-HPLC法和ELISA法分別對(duì)飼料樣品進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)表1數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出，IAC-HPLC法測(cè)值均小于ELISA法，IAC-HPLC法前處理過(guò)程需要過(guò)免疫親和柱，在過(guò)柱過(guò)程中，黃曲霉毒素B1沒(méi)有全部收回，有微量損失，從而導(dǎo)致整體檢出率偏低。ELISA法檢測(cè)結(jié)果與IAC-HPLC法檢測(cè)結(jié)果的RSD為5.4%～19.2%，其中當(dāng)樣品中黃曲霉毒素B1含量≥10μg/kg時(shí)，兩種方法結(jié)果的RSD為5.4%～9.0%，只有奶牛配合飼料黃曲霉毒素B1含量較低時(shí)，兩種方法結(jié)果的RSD值偏差較大，分析原因一是IAC-HPLC方法在過(guò)柱過(guò)程中，黃曲霉毒素B1有損失對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大，二是ELISA法檢測(cè)低含量黃曲霉毒素B1時(shí)，存在假陽(yáng)性的情況。而且隨著黃曲霉毒素B1濃度增加，兩種方法結(jié)果的重復(fù)性呈現(xiàn)良好趨勢(shì)。因此，ELISA法檢測(cè)飼料中黃曲霉毒素B1含量準(zhǔn)確度較高，可以用于飼料中黃曲霉毒素B1批量檢測(cè)。

5 結(jié)論

綜上所述，ELISA法準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好，能夠滿(mǎn)足日常監(jiān)測(cè)的需求。與IAC-HPLC法相比，ELISA法不需要對(duì)樣品進(jìn)行免疫親合柱過(guò)柱等復(fù)雜的前處理，且ELISA法可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，有效的提高了檢測(cè)效率，節(jié)省了檢測(cè)成本，可以作為日常批量監(jiān)測(cè)的首選方法。因IAC-HPLC法檢測(cè)結(jié)果可靠性強(qiáng)、可以有效避免樣品檢測(cè)的假陽(yáng)性情況，因此，在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中可以采用ELISA法對(duì)大批量飼料樣品中黃曲霉毒素B1進(jìn)行初篩快速測(cè)定，再采用IAC-HPLC法對(duì)疑似超標(biāo)陽(yáng)性樣品進(jìn)行定量確認(rèn)檢測(cè)。