基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討三棱-莪術(shù)藥對治療肝癌的作用機(jī)制

華雯 高鴻彬

摘要 目的：采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選三棱-莪術(shù)藥對治療肝癌的作用靶點(diǎn)以及相關(guān)信號通路，明確治療肝癌的作用機(jī)制。方法：通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）篩選出三棱、莪術(shù)的有效藥物成分及作用靶點(diǎn)，構(gòu)建有效成分-靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。從OMIM、DrugBank、TTD數(shù)據(jù)庫檢索與肝癌相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，并通過R語言軟件分析獲得三棱-莪術(shù)成分與肝癌的交集靶點(diǎn)。應(yīng)用Cytoscape 3.2.1軟件繪制成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。結(jié)果：共篩選出三棱-莪術(shù)藥對與肝癌的相對應(yīng)作用靶點(diǎn)共31個。共涉及與肝癌相關(guān)的GO分析125條，主要包括分子功能、生物過程、細(xì)胞組分3個方面。KEGG通路82條，主要從一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等多處通路治療肝癌。結(jié)論：本研究初步驗(yàn)證了三棱-莪術(shù)藥對通過腫瘤壞死因子信號通路、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路等治療肝癌。本研究表明三棱-莪術(shù)藥對具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，其作用機(jī)制多樣，對進(jìn)一步研究肝癌的治療提供了參考。

關(guān)鍵詞 三棱-莪術(shù)藥對;肝癌;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);中藥;成分;靶點(diǎn);通路;作用機(jī)制

Discussion on the Mechanism of Action of Rhizoma Sparganii-rhizoma Curcumae Drug Pair on the Treatment of Liver Cancer Based on Network Pharmacology

HUA Wen，GAO Hongbin

（Baoshan Branch of Renji Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200444，China）

Abstract Objective：To screen out the action targets and related signal pathways of Rhizoma Sparganii-Rhizoma Curcumae drug pair on the treatment of liver cancer by means of network pharmacology，and to clarify the mechanism of action in the treatment of liver cancer.Methods：The effective ingredients and targets of Rhizoma Sparganii-Rhizoma Curcumae drug pair were screened out through the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP），and the effective ingredient-target Protein-protein Interaction（PPI） network was constructed.We retrieved disease targets related to liver cancer from OMIM，DrugBank，and TTD databases，and used R language software analysis to obtain the intersection target of the Rhizoma Sparganii-Rhizoma Curcumae drug pair component and liver cancer.Cytoscape 3.2. software was used to draw the component-target network，and the DAVID database was used for Gene Ontology（GO） enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway analysis.Results：A total of 3 targets of Rhizoma Sparganii-Rhizoma Curcumae drug pair turmeric medicine against liver cancer were screened.A total of 125 GO analyses related to liver cancer were involved，including 3 aspects：molecular function，biological process，and cell composition.There were 82 KEGG pathways，mainly from the positive regulation of nitric oxide biosynthesis，the cell′s response to lipopolysaccharide，and the positive regulation of RNA polymerase Ⅱ promoter transcription to treat liver cancer.Conclusion：This study preliminarily verified the treatment of liver cancer by Rhizoma Sparganii-Rhizoma Curcumae drug pair through the tumor necrosis factor signaling pathway，the positive regulation of RNA polymerase Ⅱ promoter transcription，and the steroid hormone-mediated signaling pathway.This study shows that the Rhizoma Sparganii-Rhizoma Curcumae drug pair has the characteristics of multiple components and multiple targets，and its mechanism of action is diverse，which provides a reference for further research on the treatment of liver cancer.

Keywords Rhizoma Sparganii-Rhizoma Curcumae drug pair; Liver cancer; Network pharmacology; Chinese medicinal; Composition; Target; Pathway; Mechanism of action

中圖分類號：R285文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.05.015

目前，原發(fā)性肝癌在我國非常常見，近幾年增長趨勢逐漸加快，每年造成30余萬人死亡，成為我國腫瘤致死的第2大“元兇”，對人民的生命和健康安全產(chǎn)生了嚴(yán)重的威脅[1-2]。中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶，為中國人民的健康保駕護(hù)航幾千年，中醫(yī)藥治療可改善患者癥狀，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，扶正祛邪，并可有效減輕西醫(yī)藥物化療后的不良反應(yīng)，從而提高患者的生命質(zhì)量[3]。肝癌在中醫(yī)上主要屬于“癥瘕”“積聚”等范疇，在治療上針對“癥瘕”“積聚”等瘀血阻滯病機(jī)多采用活血化瘀療法[4]。中藥三棱破血逐瘀，莪術(shù)活血行氣，二者配伍活血化瘀消癥，相得益彰。

《日華子本草》曰：“三棱治婦人血脈不調(diào)，心腹痛，落腰消惡血，補(bǔ)勞?！彼幚硌芯孔C實(shí)三棱不但具有抗血栓的功效，還有溶栓的功效。莪術(shù)首載于《藥性論》，其曰“莪術(shù)能治女子血?dú)庑耐?，破痃癖冷氣”?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)莪術(shù)揮發(fā)油具有殺死癌細(xì)胞的作用，莪術(shù)醇有抑瘤作用，還可以抗血栓[5-6]。三棱-莪術(shù)對于肝癌的治療作用盡管得到諸多臨床案例驗(yàn)證，但目前現(xiàn)代藥理學(xué)對中藥三棱、莪術(shù)治療肝癌的相關(guān)作用機(jī)制研究仍不明確，尤其是在分子作用層面，故運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，依據(jù)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，研究分析三棱-莪術(shù)有效成分在治療肝癌方面的機(jī)制，從而為臨床應(yīng)用三棱-莪術(shù)治療肝癌以及后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供理論基礎(chǔ)。

資料與方法

1. 藥物成分的篩選和收集

三棱-莪術(shù)成分和靶點(diǎn)數(shù)據(jù)來源于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）。在TCMSP網(wǎng)站中查詢可以得到當(dāng)三棱-莪術(shù)藥對的有效成分信息及其藥理學(xué)信息，通過藥對的吸收、分布、代謝及排泄（Absorption，Distribution，Metabolism and Excretion，ADME）特性，將口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18作為依據(jù)來篩選有效成分。利用獲取三棱-莪術(shù)藥對中篩選出的每個成分對應(yīng)的潛在靶點(diǎn)信息，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫校正并將相關(guān)靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為基因[7]。同時運(yùn)用Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建藥物有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 疾病靶點(diǎn)獲取

利用DrugBank數(shù)據(jù)庫、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）數(shù)據(jù)庫、治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Target Database，TTD）數(shù)據(jù)庫，檢索“l(fā)iver cancer”，獲取肝癌相關(guān)靶點(diǎn)成分，從而構(gòu)建肝癌相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。

1.3 藥物與疾病關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過Uniprot數(shù)據(jù)庫對獲取的靶點(diǎn)進(jìn)行校正，統(tǒng)一藥物有效成分和疾病靶點(diǎn)信息來源，取得交集的靶點(diǎn)即為三棱-莪術(shù)藥對治療肝癌的作用靶點(diǎn)。利用String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相互作用蛋白查詢及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。

1.4 基因富集分析

采用DAVID數(shù)據(jù)庫對交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。探究三棱-莪術(shù)藥對有效成分靶點(diǎn)通過參與生物進(jìn)程和調(diào)控信號通路來治療肝癌的分子作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2. 三棱-莪術(shù)藥對活性成分的篩選和收集

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索三棱-莪術(shù)藥對的所有成分，依據(jù)ADME參數(shù)中OB、DL、BBB條件進(jìn)行篩選，結(jié)果共篩選出49個化學(xué)成分，其中三棱有7個活性成分、莪術(shù)有42個活性成分，得到三棱-莪術(shù)藥對相應(yīng)靶點(diǎn)蛋白539個。將三棱-莪術(shù)成分及靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1軟件，繪制其活性成分及靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。見圖1。圖中平均自由度為3.630，根據(jù)Degree值列出成分-靶點(diǎn)前15位。見表1。

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

通過DrugBank數(shù)據(jù)庫以及OMIM數(shù)據(jù)庫檢索與肝癌相關(guān)基因836個基因，與三棱-莪術(shù)藥對成分靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，最終得到交集靶點(diǎn)31個。將31個交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫獲取核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。見圖2。

2.3 GO富集分析

將三棱-莪術(shù)藥對相關(guān)的31個靶點(diǎn)通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集及通路分析。在GO富集分析中獲得125條生物過程條目，根據(jù)發(fā)現(xiàn)錯誤率選取其中前10位進(jìn)行重點(diǎn)分析。其中分子功能條目3個，細(xì)胞組分條目2個，生物過程條目5個。見表2。

2.4 KEGG通路富集分析

為了進(jìn)一步研究三棱-莪術(shù)藥對治療肝癌的分子作用機(jī)制，對31個核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析，并依據(jù)FDR<0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選出79條相關(guān)信號通路，如腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路等，結(jié)果以氣泡圖直觀展示。見圖3。將TNF信號通路中所包含的基因直觀展示。見圖4。

3 討論

肝癌歸屬于中醫(yī)學(xué)中“鼓脹”“癥瘕”等范疇[8]?！毒霸廊珪吩唬骸叭猓破品e氣，逐瘀血，消飲食飽滿，氣滯腹痛，除痃癖癥瘕，積聚結(jié)塊?！逼淦蒲袣猓冗m用于肝癌等有形實(shí)邪積聚之癥瘕腫塊?！侗静萁?jīng)疏》載：“莪術(shù)，味苦辛，入足厥陰肝經(jīng)氣分，能破氣中之血，主積聚諸氣，為最要之藥，與京三棱同用之良?！比廨g(shù)作為藥對同用或?qū)Ρ冗€記載于《本草新編》《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》等醫(yī)學(xué)著作中。現(xiàn)代研究表明，三棱-莪術(shù)藥對在減緩細(xì)胞生長周期中有一定作用，并可抑制腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生，通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而起到治療腫瘤的作用[9-11]。

本研究發(fā)現(xiàn)三棱的主要成分為山柰酚、異硫氰酸、三棱酸等，莪術(shù)的主要成分為1，7，7-三甲基雙環(huán)[2.2.1]庚烷-2-醇、八醛、3-（4-甲氧基苯基）丙烯酸乙酯等，治療肝癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)為AKT1、TNF、IL6、ESR1、PTGS2等。超過90%的原發(fā)性肝癌為肝細(xì)胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC），HCC的預(yù)后較差。相關(guān)研究表明，PI3K/AKT/m TOR信號通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[12]，并對重要抑癌基因p53的表達(dá)具有關(guān)鍵調(diào)控作用[13]。AKT是PI3K/AKT信號通路中極為重要的下游效應(yīng)分子，是連接作用于PI3K/AKT/m TOR信號通路的橋梁[14]。相關(guān)文獻(xiàn)報道，AKT包含AKT1、AKT2、AKT3 3種亞型，可介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用[15]。陳晶[16]研究結(jié)果顯示作用于HCC細(xì)胞增殖和遷移的主要是AKT1，阻斷AKT1能有效抑制核因子κB的表達(dá)，從而減緩肝癌的進(jìn)程。TNF是可以損傷腫瘤細(xì)胞，使其壞死的物質(zhì)，其中TNF-α發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答、調(diào)控腫瘤組織血管系統(tǒng)、誘導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死等方面的功能，在肝癌的治療中具有重要的作用[17]。IL-6是一種炎癥介質(zhì)，是一種單鏈糖蛋白，在免疫調(diào)節(jié)、炎癥及腫瘤發(fā)生方面具有廣泛的調(diào)控作用[18]。趙振雄[19]挖掘出癌旁成纖維細(xì)胞（Peri-tumor Fibroblasts，PTFs）促進(jìn)肝癌惡性特征的關(guān)鍵作用因子IL-6，利用RayBio Human Cytokine Antibody Array檢測顯示PTFs分泌量最大的細(xì)胞因子是IL-6，顯示IL-6通路在癌旁表達(dá)較癌組織高。PTGS2是參與合成PTG類物質(zhì)的一種酶，可參與炎癥、凋亡及調(diào)控腫瘤等多種生化過程[20-21]。

GO富集分析和KEGG通路分析表明，TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路是三棱-莪術(shù)藥對主要的作用通路，通過對一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、干預(yù)類固醇激素受體活性及信號通路，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等起到抑制腫瘤的作用。Toll樣受體4（TLR4）在全身各組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)[22]，TLR4在肝癌細(xì)胞株Hep3B中高表達(dá)，其增殖能力隨TLR4被干擾受到明顯抑制，且TLR4于膜表面表達(dá)情況與外周血內(nèi)毒素水平正相關(guān)，而內(nèi)毒素對肝癌的發(fā)展起到促進(jìn)作用，提示TLR4與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)[23]。蘇純潔等[24]采用免疫組織化學(xué)染色法檢測90例肝癌組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的表達(dá)，結(jié)果顯示HIF-1α信號通路激活是導(dǎo)致肝癌組織中PD-L1表達(dá)升高的原因之一。

綜上所述，本研究綜合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及文獻(xiàn)報道，初步驗(yàn)證了三棱-莪術(shù)藥對通過腫瘤壞死因子信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路，通過對一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控和RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，干預(yù)類固醇激素受體活性及信號通路，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等發(fā)揮抗腫瘤生物學(xué)作用，表明三棱-莪術(shù)藥對治療肝癌是多成分、多靶點(diǎn)、多通路。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)闡明三棱-莪術(shù)藥對治療肝癌可能的靶點(diǎn)和分子機(jī)制，為臨床治療肝癌提供客觀依據(jù)。

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（2020-09-17收稿 本文編輯：楊覺雄）