HPLC測定薏苡仁中玉米赤霉烯酮的不確定度評定

莫毛燕，程 敏，張龍開，林偉斌，譚麗容

(弘正道(中國)中藥研究有限公司，廣東 廣州 510665)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)，又稱F-2雌性發(fā)情毒素，是由玉米赤霉菌、禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌等真菌產生的有毒代謝產物，廣泛存在于谷類作物，具有較強的生殖毒性和致畸作用，會對人體產生較大的危害[1-2]。薏苡仁是藥食兩用的常用中藥，使用范圍廣、用量大，但薏苡仁容易被真菌毒素污染，其檢出玉米赤霉烯酮的頻率非常高[3]。在2020版《中國藥典》中，明確規(guī)定了薏苡仁玉米赤霉烯酮的限量要求。因此，準確測定薏苡仁中玉米赤霉烯酮的含量具有重要意義。

然而在實際檢測工作中，測量結果與實際值往往存在一定的偏離，所以測量結果的不確定度評定顯得尤為重要。本文根據(jù)JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[4]和CNAS-GL06：2019《化學分析中不確定度的評估指南》[5]規(guī)定的基本方法和程序，系統(tǒng)全面地對高效液相色譜法測定薏苡仁中玉米赤霉烯酮含量的測量不確定度進行評定，以期為玉米赤霉烯酮檢測數(shù)據(jù)使用和準確評價提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(DIONEX Ultimate 3000，配熒光檢測器)，美國Thermo Fisher公司；MS204TS型電子天平(d=0.1 mg)，瑞士Mettler公司；FJ-200J型高速分散均質機，上海滬析實業(yè)有限公司；ST16R型離心機，美國Thermo Fisher公司；玉米赤霉烯酮免疫親和柱，上海安譜實驗科技股份有限公司；Visiprep DL型固相萃取裝置，Supelco公司。

玉米赤霉烯酮對照品溶液(標示濃度49.9 μg/mL)，美國o2si公司；甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，德國Merck公司；氯化鈉(分析純)，廣州化學試劑廠；所有用水均為超純水；市售薏苡仁藥材。

1.2 試驗方法

1.2.1 對照品溶液的配制

精密量取玉米赤霉烯酮標準溶液1 mL，加甲醇制成每 1 mL含5 μg的溶液，作為標準貯備溶液。精密量取標準貯備溶液1 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得標準使用液。

1.2.2 供試品溶液的制備

取薏苡仁粉末約20 g(過二號篩)，精密稱定，置于勻質瓶中，加入氯化鈉4 g，精密加入90%乙腈溶液100 mL，高速攪拌2 min(攪拌速度大于11000 r/min)，離心10 min(離心速度4000 r/min)，精密量取上清液10 mL，置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，離心10 min(離心速度4000 r/min)，量取上清液20.0 mL，通過免疫親和柱，流速每分鐘3 mL，用水10 mL洗脫，棄去洗脫液，使空氣進入柱子，將水擠出柱子，再用適量甲醇洗脫，收集洗脫液，置2 mL量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5 C18，4.6×250 mm，5 μm；柱溫：30 ℃；流動相:乙腈:水=50:50(V/V)，流速：1.0 mL/min；檢測器：熒光檢測器；激發(fā)波長：232 nm，發(fā)射波長：460 nm。

1.2.4 測定法

分別精密吸取“1.2.1”項下對照品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪制標準曲線。另精密吸取供試品溶液30 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，從標準曲線上讀出供試品中相當于玉米赤霉烯酮的量，計算，即得。

2 結果與分析

2.1 數(shù)學模型的建立

不確定度的計算，首先明確被測值計算的數(shù)學模型，從而分析其可能的不確定度來源。高效液相色譜法測定薏苡仁中玉米赤霉烯酮含量計算數(shù)學模型為：

式中，X為薏苡仁試樣中玉米赤霉烯酮的含量，μg/kg；C為由標準曲線計算得到玉米赤霉烯酮的質量，ng；V1為試樣稀釋總體積，mL；V2為供試品溶液進樣體積，μL；m為試樣質量，g；1000為單位換算系數(shù)；rep為測量重復性；Rec為回收率。

2.2 不確定度的來源分析

根據(jù)數(shù)學模型及測量過程分析，高效液相色譜法測定薏苡仁中玉米赤霉烯酮的測量不確定度有以下幾個來源：測量重復性引入的不確定度；標準溶液配制引入的不確定度；標準曲線擬合引入的不確定度；樣品稱量過程引入的不確定度；樣品溶液體積引入的不確定度；進樣體積引入的不確定度；回收率引入的不確定度。

2.3 測量不確定度評定

2.3.1 測量重復性引入的不確定度urel(rep)

測量重復性引入的標準不確定度：

=0.372 μg/kg

測量重復性引入的相對標準不確定度：

2.3.2 標準溶液配制引入的不確定度urel(CS)

標準溶液配制引入的不確定度u(CS)，包括標準物質溶液引入的不確定度u1(CS)、標準貯備液配制引入的不確定度u2(CS)、標準使用液配制引入的不確定度u3(CS)。

2.3.2.1 標準物質溶液引入的不確定度u1rel(Cs)

玉米赤霉烯酮標準物質證書給出的標準值為49.9 μg/mL，擴展不確定度為U=0.64 μg/mL(k=2)，則玉米赤霉烯酮標準物質引入的相對標準不確定度為：

2.3.2.2 標準貯備液配制帶來的不確定度u2rel(Cs)

2.3.2.3 標準使用液配制帶來的不確定度u3rel(Cs)

2.3.2.4 標準溶液配制過程的合成不確定度urel(CS)

標準溶液配制引入的相對標準不確定度合成為：

2.3.3 標準曲線擬合引入的不確定度urel(S)

取“2.3.1”項下標準使用液按法注入液相色譜儀測定，每個進樣量水平測定2次，測得的峰面積如表1所示。

表1 標準曲線測量結果

標準曲線采用最小二乘法進行線性擬合，所得回歸方程為A=16792.6157C+210.1207，相關系數(shù)R2=0.9999，其中A為玉米赤霉烯酮的峰面積，C為玉米赤霉烯酮進樣量。樣品重復測定6次，峰面積代入線性回歸方程計算得到樣品中玉米赤霉烯酮的質量分別為0.659、0.682、0.668、0.681、0.665、0.686 ng，平均值C樣=0.674 ng，標準曲線擬合引入的標準不確定度按以下公式計算：

式中：SA—標準曲線峰面積A的殘余標準差

b—標準曲線的斜率，b=16792.6157

p—樣品的重復測定次數(shù)，p=6

n—標準溶液測定總次數(shù)，n=10

C樣—樣品用該曲線進行測定6次，測得玉米赤霉烯酮的平均質量，C樣=0.674 ng

Ci—標準曲線各點進樣量，ng

Ai—標準曲線各點峰面積的測定值

a—標準曲線的截距，a=210.1207

因此，由標準曲線擬合引入的相對標準不確定度為：

2.3.4 樣品稱量過程引入的不確定度urel(m)

實驗過程使用萬分之一電子天平稱取20.0000 g樣品，查天平檢定證書，其擴展不確定度為U=0.2 mg，k=2，則稱量過程引入的標準不確定度為：

2.3.5 樣品溶液體積引入的不確定度urel(V1)

2.3.5.1 玻璃量器校準引入的不確定度u1rel(V1)

本實驗前處理過程中使用到100 mL單標吸量管1次，10 mL單標吸量管1次，20 mL單標吸量管1次，50 mL容量瓶1次，2 mL容量瓶1次，所用的玻璃量器均為A級，查檢定證書，確定其擴展不確定度U。玻璃量器引入的相對標準不確定度如表2所示。

表2 樣品前處理過程使用的玻璃量器體積校準引入的不確定度

將表2中各不確定分量進行合成，得到玻璃量器校準引入的相對標準不確定度：

2.3.5.2 體積因溫度變化引入的不確定度u2rel(V1)

表3 溫度波動引入的不確定度

將表3中各不確定分量進行合成，得到體積因溫度變化引入的相對標準不確定度：

2.3.5.3 樣品溶液體積的合成不確定度urel(V1)

樣品溶液體積引入的相對標準不確定度合成為：

2.3.6 進樣體積引入的不確定度urel(V2)

進樣體積引入的不確定度屬于高效液相色譜儀的不確定度分量，在測量重復性不確定度分量中已進行了評定，在此不再重復評定。

2.3.7 回收率引入的不確定度urel(Rec)

表4 回收率引入的相對標準不確定度(n=9)

2.4 計算擴展不確定度并報告結果

將各不確定度分量進行合成：

=0.0170

薏苡仁樣品中玉米赤霉烯酮含量為56.081 μg/kg，則合成標準不確定度為：

取包含因子k=2，置信概率95%，測量結果的擴展不確定度為：

U=k×u(X)=2×0.953=1.91 μg/kg

因此，高效液相色譜法測定薏苡仁中玉米赤霉烯酮含量測定結果可表示為：X=(56.08±1.91)μg/kg，k=2，置信概率95%。

3 結 論

本文對高效液相色譜法測定薏苡仁中玉米赤霉烯酮含量的不確定度進行了量化分析。結果表明，影響玉米赤霉烯酮檢測結果準確性的重要不確定度分量為回收率，次要不確定度分量分別為標準溶液配制和標準曲線擬合。因此，在日常檢驗過程中，應通過規(guī)范檢測人員的操作、優(yōu)化樣品前處理方法、調整儀器的性能、選用精度高并計量合格的玻璃量器、加強實驗環(huán)境溫度的控制等方式，來減小測量結果的不確定度，從而提高檢測結果的準確性。