止得咳顆粒止咳作用研究

梁 潔 ，陳輝華 ，信晨曦，唐云麗，姜 楓，陳日蘭，鄭飄雪 ，陳 俊*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530200；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011）

咳嗽是臨床上比較常見(jiàn)的癥狀，多由呼吸系統(tǒng)疾病引起，該癥狀在學(xué)齡前期及學(xué)齡期兒童中尤為多見(jiàn)［1］。劇烈、頻繁的咳嗽會(huì)影響到人們的正常生活，需給予必要處理，如存在炎癥還需進(jìn)行抗炎治療?？人缘闹饕l(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，目前認(rèn)為主要與細(xì)胞免疫失衡、氣道慢性炎癥的形成有關(guān)［2］。鎮(zhèn)咳藥物作用機(jī)制主要分為中樞性鎮(zhèn)咳（直接抑制咳嗽中樞）和外周性鎮(zhèn)咳（抑制咳嗽反射其他環(huán)節(jié)）兩類：中樞性鎮(zhèn)咳作用主要是通過(guò)某些神經(jīng)遞質(zhì)來(lái)完成，單胺類5-HT 是中樞性鎮(zhèn)咳作用機(jī)制的一個(gè)重要組成部分，該類鎮(zhèn)咳藥物可通過(guò)與5-HT 受體相互作用，促進(jìn)中樞5-HT 釋放而達(dá)到鎮(zhèn)咳效果［3-5］；外周性鎮(zhèn)咳機(jī)制中則以抗炎和局部保護(hù)作用為主［6］?？人栽谂R床上主要是對(duì)癥處理，如抗生素、鎮(zhèn)咳藥等是常用的藥物［7］，這些藥物存在維持時(shí)間短暫、易造成病情反復(fù)及不良反應(yīng)常見(jiàn)等缺陷。中醫(yī)藥注重標(biāo)本兼治，在治療咳嗽方面積累了大量的經(jīng)驗(yàn)。中藥復(fù)方制劑止得咳顆粒為臨床經(jīng)驗(yàn)方，由龍脷葉、射干、桔梗、白前、黃芩、青天葵、枇杷葉、薄荷、荊芥、柴胡等10 味藥材科學(xué)配伍組成，主治外感咳嗽，具有宣肺、止咳、化痰、利咽的功效，用于上呼吸道感染以及急、慢性支氣管炎。該方臨床療效顯著、副作用少、安全低毒［8］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)止得咳顆粒具有一定的抗炎作用［9］?；诖?，本實(shí)驗(yàn)開(kāi)展針對(duì)止得咳顆粒止咳方面的研究，以評(píng)價(jià)止得咳顆粒的鎮(zhèn)咳作用，并探討其作用機(jī)制，以期為該復(fù)方制劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種（KM）小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002。于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：清潔Ⅱ級(jí)，溫度18～22 ℃，相對(duì)濕度50%。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。

1.2 試劑與藥物 止得咳顆粒由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院制劑室生產(chǎn)（批號(hào)：20190701；每袋10 小包，每包15 g），由桔梗、白前、龍脷葉、枇杷葉、青天葵、射干、柴胡、黃芩、荊芥、薄荷等10味中藥組成；磷酸可待因片（青海制藥廠有限公司，批號(hào)：20180433）；氨水（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20160322；分析純）；小鼠5-羥色胺（5-HT）、5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）、去甲腎上腺素（NE）、P 物質(zhì)酶聯(lián)免疫分析試劑盒（北京康普同創(chuàng)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20191012）。

1.3 主要儀器 WH-2000 超聲波霧化器（廣東粵華醫(yī)療器械廠）；SIM-F140AY65-PC 制冰機(jī)（日本大阪松下電器）；ST-360酶標(biāo)儀（上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司）；LHS-250SC 恒溫恒濕箱（上海一恒科學(xué)儀器）；離心機(jī)，超低溫冰箱。

2 方 法

2.1 氨水引咳實(shí)驗(yàn) 取KM 小鼠60 只，雌雄各半，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、磷酸可待因組（0.011 g/kg）及止得咳顆粒高、中、低劑量組（1.137 g/kg、2.275 g/kg、4.550 g/kg，臨床用量按體質(zhì)量換算成小鼠等效劑量作為高劑量［9］），每組10只。灌胃給藥，給藥量20 ml/kg，每天1 次，連續(xù)7 d，空白組與模型組灌服等體積純化水。末次給藥后1 h，予濃氨水噴霧20 s（正常組除外），噴霧終止后，立即取出小鼠，記錄2 min內(nèi)小鼠的咳嗽次數(shù)和潛伏期。各組小鼠眼眶取血，取出腦和肺組織，生理鹽水除去血液，放入離心管，加入PBS，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 指標(biāo)檢測(cè) 運(yùn)用酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒檢測(cè)小鼠腦組織中5-HT、5-HIAA、NE水平，以及血清與肺組織中P 物質(zhì)水平。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各指標(biāo)濃度。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 止得咳顆粒對(duì)小鼠咳嗽的影響 與模型組比較，止得咳顆粒各劑量組和磷酸可待因組均可延長(zhǎng)小鼠咳嗽潛伏期并減少小鼠2 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)，其中止得咳顆粒中、高劑量組及磷酸可待因組小鼠咳嗽潛伏期顯著延長(zhǎng)（P＜0.01），咳嗽次數(shù)顯著減少（P＜0.01）。結(jié)果顯示，隨著止得咳顆粒劑量的增加，小鼠咳嗽潛伏期逐漸延長(zhǎng)，咳嗽次數(shù)逐漸減少，說(shuō)明止得咳顆粒對(duì)氨水引起的咳嗽有抑制作用且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，其止咳作用隨劑量增加而增強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 止得咳顆粒對(duì)小鼠咳嗽的影響 （）

表1 止得咳顆粒對(duì)小鼠咳嗽的影響 （）

注：與模型組比較，①P＜0.01

組 別模型組磷酸可待因組止得咳顆粒低劑量組止得咳顆粒中劑量組止得咳顆粒高劑量組n 10 10 10 10 10劑量（g/kg）—0.011 1.137 2.275 4.550咳嗽潛伏期（s）45.83±19.43 63.83±13.29 ①57.91±22.72 64.58±17.09①66.00±24.85①2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)（次）17.33±11.97 3.75±2.22①12.33±3.11 5.83±2.59①5.25±1.71①

3.2 止得咳顆粒對(duì)小鼠腦組織中中樞神經(jīng)遞質(zhì)的影響 與正常組比較，模型組小鼠腦組織中5-HT、5-HIAA、NE含量均有所降低，其中5-HT含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，止得咳顆粒高劑量組和磷酸可待因組小鼠腦組織中5-HT、5-HIAA、NE 含量顯著增高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 止得咳顆粒對(duì)小鼠腦組織中5-HT、5-HIAA、NE水平的影響 （）

注：與正常組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

組 別正常組模型組磷酸可待因組止得咳顆粒低劑量組止得咳顆粒中劑量組止得咳顆粒高劑量組n 劑量（g/kg）10 10 10 10 10 10— —0.011 1.137 2.275 4.550 5-HT（ng/L）947.40±280.22 686.66±127.69①891.61±223.56②820.48±131.46 865.49±183.46 880.49±220.55②5-HIAA（ng/L）58.45±6.59 47.36±1.67 71.08±6.02③57.32±4.68 62.25±5.19 68.17±1.65②NE（ng/L）716.25±31.88 656.32±31.95 802.53±52.50②624.19±40.49 733.39±36.27 775.99±35.13②

3.3 止得咳顆粒對(duì)小鼠血清、肺組織中P 物質(zhì)（SP）水平的影響 與正常組比較，模型組血清及肺組織中SP含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，止得咳顆粒中、高劑量組和磷酸可待因組小鼠血清及肺組織中SP含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 止得咳顆粒對(duì)小鼠血清、肺組織中SP水平的影響 （）

表3 止得咳顆粒對(duì)小鼠血清、肺組織中SP水平的影響 （）

注：與正常組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

組 別正常組模型組磷酸可待因組止得咳顆粒低劑量組止得咳顆粒中劑量組止得咳顆粒高劑量組n 劑量（g/kg）10 10 10 10 10 10— —0.011 1.137 2.275 4.550血清SP（ng/L）3 788.16±209.68 4 927.85±253.62①3 519.74±542.32③4 886.18±272.33 4 556.14±211.95②4 072.59±311.77③肺組織SP（ng/L）3 488.16±299.68 3 915.79±419.66①3 318.75±431.97③3 687.99±158.48 3 597.53±252.78②3 514.47±234.48②

4 討 論

現(xiàn)有的鎮(zhèn)咳藥主要是中樞性或外周性鎮(zhèn)咳藥，雖種類繁多，但存在療效不佳、副作用大、作用范圍窄等不足［10］。止得咳顆粒是一種純中藥復(fù)方制劑，方中龍脷葉性平，味甘、淡，入肺經(jīng)，具清熱化痰、止咳平喘之功；射干味苦，性寒，具有清熱解毒、消痰、利咽之功效，亦歸肺經(jīng)，二者共為君藥；桔梗辛散苦泄，歸肺經(jīng)，善于開(kāi)宣肺氣、祛痰利氣；白前味辛、苦，性微寒，長(zhǎng)于降氣化痰；二者協(xié)同，一宣一降，以復(fù)肺氣之宣降，增強(qiáng)君藥宣肺止咳之力；黃芩清肺瀉火，桔梗、白前共為臣藥；青天葵清肺止咳、散瘀消腫；枇杷葉清肺止咳，祛痰平喘；荊芥、薄荷疏風(fēng)解表，祛邪利咽；柴胡和解表里，退熱；五者均為佐使之用。諸藥合用，使上焦風(fēng)熱得以疏散，肺氣得以宣降則咳嗽止［9］。

本研究通過(guò)氨水引咳模型探討止得咳顆粒的鎮(zhèn)咳作用和機(jī)制，結(jié)果顯示，止得咳中、高劑量組和磷酸可待因組均可顯著延長(zhǎng)小鼠咳嗽潛伏期并減少小鼠2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)（P＜0.01），隨著止得咳劑量的增加，小鼠咳嗽潛伏期逐漸延長(zhǎng)，咳嗽次數(shù)逐漸減少，提示止得咳顆粒對(duì)氨水引起的咳嗽有抑制作用且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

止咳藥物鎮(zhèn)咳的藥理作用機(jī)制至今尚不明確，有研究認(rèn)為可能與阻滯NM-DA受體［11］、激動(dòng)σ-1［12］和5-HT1B/D［13］等受體作用相關(guān)。在臨床前研究特定的咳嗽模型中，以上受體的選擇性配體可獨(dú)立展現(xiàn)出鎮(zhèn)咳作用，而后2 種受體的藥理性拮抗劑可阻斷右美沙芬的鎮(zhèn)咳作用［14］。5-羥色胺（5-HT）廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織，在大腦皮層及神經(jīng)突觸內(nèi)含量較高，它是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)［15-20］。作為人體的內(nèi)源性活性物質(zhì)，5-HT 與人體很多生理病理活動(dòng)密切相關(guān)。文獻(xiàn)表明單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT 具有重要的中樞性鎮(zhèn)咳作用［3，21］，可作用于 5-HT1B/D 受體產(chǎn)生鎮(zhèn)咳作用。5-吲哚乙酸（5-HIAA）是5-HT 酸代謝的最終產(chǎn)物。去甲腎上腺素（NE）參與5-HT的分泌調(diào)節(jié)，NE可通過(guò)胞體和樹(shù)突區(qū)域里的α1 受體對(duì)5-HT 的釋放進(jìn)行正反饋調(diào)節(jié)作用，當(dāng)α1 受體與NE 結(jié)合時(shí)，將刺激5-HT能神經(jīng)元釋放5-HT［22-23］。本研究發(fā)現(xiàn)止得咳顆?？商岣咝∈竽X組織中5-HT、5-HIAA、NE的含量，提示止得咳顆?？赡苁峭ㄟ^(guò)直接或間接促進(jìn)5-HT 的釋放產(chǎn)生中樞鎮(zhèn)咳作用。任何導(dǎo)致氣道血漿滲出增加的化學(xué)物質(zhì)如組胺、緩激肽或P 物質(zhì)均可間接刺激咳嗽傳入神經(jīng)感受器而誘發(fā)咳嗽［24］。多種理化刺激能誘導(dǎo)P 物質(zhì)釋放，從而刺激咳嗽傳入神經(jīng)感受器和C 纖維誘發(fā)咳嗽［25］。止得咳顆?？山档托∈笱寮胺谓M織中P 物質(zhì)含量，提示該制劑可能通過(guò)抑制P 物質(zhì)釋放而發(fā)揮其外周鎮(zhèn)咳作用。

中醫(yī)注重整體觀念，講究標(biāo)本兼治，中成藥制劑成分復(fù)雜，靶點(diǎn)多，可以整體調(diào)理患者的機(jī)體，提高全身免疫力，減少反復(fù)發(fā)作。本研究發(fā)現(xiàn)止得咳顆粒有明顯的止咳和抗炎作用，與5-HT、5-HIAA、NE 和P 物質(zhì)含量的變化有關(guān)，初步揭示了止得咳顆粒治療咳嗽的可能作用機(jī)制和靶點(diǎn)。