姜黃素抑制肺癌細胞A549上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制研究

鄭爽，許林暉，夏書月

（沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，遼寧沈陽 110075）

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，多數(shù)肺癌患者在就診時就已經(jīng)發(fā)生遠處器官轉(zhuǎn)移，喪失了手術機會[1]，不僅如此，肺癌術后的復發(fā)和轉(zhuǎn)移也是影響患者生存率的重要因素。因此，找尋有效抑制肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的藥物和新的治療靶點是目前亟待解決的問題。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是一個動態(tài)細胞過程，細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中細胞骨架發(fā)生重塑，細胞間接觸蛋白如E-cadherin 丟失或減弱，上皮特性減弱，同時細胞獲得間質(zhì)特征，如Vimentin、N-cadherin、Snail等標志物表達升高，最終導致細胞的侵襲和遷移能力增強[2-3]。因此，以阻止上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生為靶點，抑制腫瘤侵襲是目前關注的熱點[4]。姜黃素、雷公藤紅素、青蒿素、雷公藤甲素、辣椒素在2007年被《Cell》雜志列為最有可能被開發(fā)成為現(xiàn)代藥物的5 種傳統(tǒng)天然藥用化合物[5]，對治療腫瘤具有重大的意義。姜黃素是從中藥材中提取的一種化學成分，是植物中稀有的二酮類化合物。姜黃素可抑制腫瘤細胞增殖，且對正常細胞無明顯的細胞毒效應，因而在抗腫瘤治療中得到廣泛的研究與關注[6]。研究證實，姜黃素不僅具有抗腫瘤作用，同時還可以抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[7-8]。目前研究表明，姜黃素有多個治療靶點，包括多種基因、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、信號傳導通道等。隨著對姜黃素認識的深入，人們發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）同樣也是姜黃素下游重要的作用靶點[9-10]。

lncRNA 是長度＞200 個核苷酸的非編碼RNA，可通過基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯、翻譯后水平調(diào)控基因表達，在多種生理學（細胞增殖、表觀調(diào)控、基因組印記、X 染色體失活等）和病理學（癌癥、神經(jīng)退行性疾病、免疫功能障礙、心血管及代謝性疾病等）過程中發(fā)揮重要作用[11]。近年來研究者發(fā)現(xiàn)，lncRNA 在腫瘤治療過程中同樣發(fā)揮重要的調(diào)控作用[12]。許多l(xiāng)ncRNA 的異常表達是導致腫瘤治療失敗的重要原因[13]。HOTAIR 是第一個被發(fā)現(xiàn)具有反式作用的lncRNA。研究證實，HOTAIR 是上皮源性惡性腫瘤特征性分子事件，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，以及預測預后上發(fā)揮重要的作用。那么，HOTAIR 是否介導姜黃素在肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程值得關注。

本研究檢測HOTAIR、E-cadherin、N-cadherin 及Snail mRNA 和蛋白相對表達量及l(fā)ncRNA 的表達，找尋介導姜黃素發(fā)揮作用的具體lncRNA，并進一步探討這一過程發(fā)生的具體機制，為進一步明確姜黃素在肺癌治療過程中發(fā)揮作用的機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人肺癌細胞株A549 購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，細胞在含100 mL/L 胎牛血清（FBS）的1640 培養(yǎng)基中，于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。細胞每天換液處理，待細胞密度生長至80%進行傳代。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2 肺癌組織標本

選取2013年5月—2015年6月于沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院行肺癌切除的患者93 例。患者術前均未進行放化療。癌旁組織標本（距離腫瘤＞2 cm）作為正常組織對照。根據(jù)患者病理結果，RT-PCR 分析HOTAIR 的表達，按照表達量分為高表達和低表達，分析HOTAIR 表達與年齡、性別、分化程度、淋巴結轉(zhuǎn)移及TNM 分期之間的關系。

1.3 方法

1.3.1 CCK-8法檢測A549細胞活性取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)無血清培養(yǎng)基饑餓處理24 h 后，胰酶消化細胞并將細胞制備成細胞懸液加入到96 孔培養(yǎng)板中，設立6 個復孔；加入0.0 μmol/L、1.0 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、10.0 μmol/L、20.0 μmol/L、25.0 μmol/L 和50.0 μmol/L 濃度的姜黃素，對照組加入相同體積磷酸鹽緩沖液（PBS），待細胞生長到特定時間后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h；酶標儀450 nm 處檢測OD 值，以OD 值作為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.3.2 Transwell 實驗檢測A549 細胞遷移、侵襲能力遷移實驗：Tranwell 小室上室內(nèi)鋪入姜黃素誘導后的50 000 個細胞，以未加藥組為對照組，下室中加入600 μL 含10% FBS 的培養(yǎng)基，小室置于24 孔板中，于孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。4%多聚甲醛固定細胞，0.1%結晶紫染色，顯微鏡下觀察結果并拍照。每組設置3 個復孔，所有實驗獨立重復3 次。侵襲實驗：Matrigel 膠4℃冰箱中過夜充分溶解后，與培養(yǎng)基按照1∶8 稀釋，預冷的槍頭吸取100 μL Matrigel 膠鋪于上室，將Transwell 小室置于孵箱內(nèi)90 min 后取出。其余分組以及步驟同遷移實驗。

1.3.3 Western blotting 檢測E-cadherin、N-cadherin、Snail 蛋白的相對表達量細胞刮刀收集對照組及姜黃素誘導組細胞，加入RIPA 細胞裂解液，提取各組細胞蛋白。BCA 法檢測各組細胞蛋白濃度。將樣品調(diào)成相同濃度后加入Running Buffer，100℃變性5 min。取50 μg 蛋白樣品在10%分離膠中電泳，電泳結束后采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，轉(zhuǎn)膜條件：恒壓50 V，2 h。5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h 并孵育相應抗體，4℃過夜。三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液（TBST）清洗干凈后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，ECL 發(fā)光，以GAPDH 為內(nèi)參。通過Image J 對條帶進行灰度值分析。實驗重復3 次。

1.3.4 qRT-PCR 檢測HOTAIR、E-cadherin、Ncadherin、Snail mRNA 的相對表達量采用1 mL Trizol 試劑提取肺癌組織、癌旁正常組織、對照組細胞及姜黃素誘導組細胞總RNA，采用紫外分光光度計測定RNA 濃度，取1 μg 總RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄cDNA 條件：42℃預變性15 min，70℃變性15 min，1 個循環(huán)。引物通過Primer 3 在線設計，經(jīng)Blast 檢測評分后由上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR 按照20 μL 反應體系（cDNA 2 μL，GoTap qPCR Master Mix，2× 10 μL，正反向引物各0.4 μL，Nuclease-Free Water 7.2 μL），反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，共40 個循環(huán)，記錄每個樣品的Ct 值，按照2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。每個樣品設置3 個復孔，每個實驗獨立重復3 次。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.5 姜黃素處理前后的肺癌細胞A549 轉(zhuǎn)錄組測序姜黃素處理24 h 后提取細胞總RNA，對提取的RNA進行質(zhì)量檢測，采用Illumina HiSeq 2000 高通量測序平臺對濃度、純度和完整性符合測序質(zhì)量要求的樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序。構建文庫，通過應用Agilent 2100 Bioanalyzer 檢測總RNA 濃度、RIN 值及28S/18S片段大小。采用邊合成邊測序技術，利用BGISEQ-500 平臺進行高通量測序，得到100 bp 的測序讀長。篩選通過測序獲得的原始數(shù)據(jù)中低質(zhì)量、接頭污染及未知堿基N 含量過高的reads，獲得有效reads，即clean reads，以保證結果的可靠性。本部分實驗交由北京諾禾致源公司完成。

1.3.6 細胞轉(zhuǎn)染HOTAIR 過表達質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒購自上海吉凱基因科技有限公司。細胞傳代后，待細胞融合度達到約50% 左右，使用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑盒進行轉(zhuǎn)染。根據(jù)轉(zhuǎn)染說明書首先取2 支2.5 mL 的無菌EP 管，隨后在管中加入250 μL 的Opti-MEM 培養(yǎng)基，2 支EP 管分別加入5 μL Lipofectamine 3000 和P3000 轉(zhuǎn)染試劑，Lipofectamine 3000 的EP 管中加入5 μL 的質(zhì)粒，靜置3 min，將Lipofectamine 3000 與P3000 試劑混合，室溫靜置3 min，最后加入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)6 h 后換液，轉(zhuǎn)染后24 h 收集細胞，提取總RNA，驗證轉(zhuǎn)染效率。按照同樣步驟轉(zhuǎn)染后進行Western blotting、Transwell及CCK-8 實驗，步驟同前。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，進一步兩兩比較用秩和檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，比較用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 姜黃素抑制肺癌細胞增殖

CCK-8 實驗結果證實，姜黃素誘導肺癌細胞A549 24 h 后，不同濃度組肺癌細胞A549 的OD 值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），隨著姜黃素濃度的升高，OD 值降低。25.0 μmol/L 姜黃素能有效抑制A549 細胞增殖，故將此濃度選做本實驗使用濃度。見表2和圖1。

圖1 姜黃素抑制肺癌細胞A549增殖 （±s）

表2 不同濃度肺癌細胞A549 OD值比較 （±s）

表2 不同濃度肺癌細胞A549 OD值比較 （±s）

組別姜黃素0.0 μmol/L組姜黃素1.0 μmol/L組姜黃素2.5 μmol/L組姜黃素5.0 μmol/L組姜黃素10.0 μmol/L組姜黃素20.0 μmol/L組姜黃素25.0 μmol/L組姜黃素50.0 μmol/L組F 值P 值OD值0.46±0.06 0.45±0.05 0.41±0.02 0.38±0.03 0.33±0.04 0.19±0.01 0.11±0.01 0.10±0.01 6.514 0.000

2.2 姜黃素抑制肺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移

Transwell 實驗結果顯示，姜黃素誘導肺癌細胞A549 24 h 后，姜黃素誘導組抑制肺癌細胞A549 的侵襲、遷移能力與對照組比較：姜黃素誘導組細胞侵襲數(shù)（208.66±13.61）個，對照組（357.33±19.01）個，差異有統(tǒng)計學意義（t=11.01，P=0.0004）。姜黃素誘導組細胞遷移數(shù)（223.10±8.88）個，對照組（411.66±16.80）個，差異有統(tǒng)計學意義（t=17.190，P=0.000）。見圖2。

圖2 姜黃素抑制肺癌細胞A549的侵襲與遷移

2.3 姜黃素抑制肺癌細胞A549上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

qRT-PCR 和Western blotting 實驗結果顯示，姜黃素誘導肺癌細胞A549 后，姜黃素誘導組的E-cadherin 、N-cadherin 、Snail mRNA 和蛋白相對表達量與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），姜黃素誘導組N-cadherin、Snail mRNA 和蛋白相對表達量升高，E-cadherin mRNA 和蛋白相對表達量下降。見表3、4 及圖3。

圖3 姜黃素抑制肺癌細胞A549上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

表3 兩組肺癌細胞A549中E-cadherin、N-cadherin、Snail mRNA 相對表達量比較 （±s）

表3 兩組肺癌細胞A549中E-cadherin、N-cadherin、Snail mRNA 相對表達量比較 （±s）

組別對照組姜黃素誘導組t 值P 值E-cadherin mRNA 0.99±0.12 0.33±0.14 36.892 0.007 N-cadherin mRNA 1.03±0.11 2.50±0.10 10.911 0.008 Snail mRNA 0.98±0.13 2.32±0.10 10.350 0.009

表4 兩組肺癌細胞A549中E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白相對表達量比較 （±s）

表4 兩組肺癌細胞A549中E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白相對表達量比較 （±s）

組別對照組姜黃素誘導組t 值P 值E-cadherin蛋白1.02±0.02 0.35±0.03 14.713 0.004 N-cadherin蛋白0.48±0.03 1.27±0.02 51.082 0.000 Snail蛋白0.38±0.04 0.98±0.05 10.355 0.009

2.4 HOTAIR 在肺癌組織中的表達及其與臨床病理參數(shù)之間的關系

癌旁正常組HOTAIR mRNA 的相對表達量（0.05±0.06）與肺癌組HOTAIR mRNA 的相對表達量（0.14±0.10）比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=7.495，P=0.000），肺癌組高于癌旁正常組。通過分析HOTAIR 與肺癌患者臨床病理參數(shù)之間的關系，發(fā)現(xiàn)HOTAIR 的表達與患者的TNM 分期、分化程度、淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關，與患者年齡、性別無關。 結果提示HOTAIR 參與了肺癌的進展。見表5。

2.5 姜黃素抑制lncRNA HOTAIR表達

qRT-PCR 結果證實，姜黃素抑制肺癌細胞lncRNA HOTAIR 的表達最為明顯（見表6）。測序結果顯示，姜黃素對多個lncRNA 表達均有調(diào)控作用（見圖4）。

圖4 姜黃素抑制lncRNA HOTAIR的表達

表6 兩組A549細胞中l(wèi)ncRNA相對表達量比較（±s）

表6 兩組A549細胞中l(wèi)ncRNA相對表達量比較（±s）

組別對照組姜黃素誘導組t 值P 值HOTAIR 1.00±0.03 0.23±0.09 42.780 0.000 TUG1 1.03±0.01 0.42±0.03 33.180 0.000 LINC01125 0.98±0.02 0.53±0.10 24.130 0.000 LINC00662 1.02±0.03 0.89±0.12 4.660 0.198組別對照組姜黃素誘導組t 值P 值H19 0.99±0.03 0.44±0.1 29.070 0.000 NBR2 1.04±0.04 0.93±0.13 1.370 0.999 LINC00960 0.97±0.02 0.68±0.12 16.730 0.000組別對照組姜黃素誘導組t 值P 值GAS5 0.96±0.03 0.52±0.13 23.860 0.000 MEG3 1.05±0.02 1.39±0.12 22.480 0.000 LINC00475 1.01±0.02 0.89±0.11 5.210 0.099

2.6 姜黃素通過HOTAIR 抑制肺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換

為確定HOTAIR 是參與姜黃素調(diào)控肺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的下游效應因子，本研究對肺癌細胞A549 轉(zhuǎn)染HOTAIR 質(zhì)粒再給予姜黃素干預。結果證實姜黃素抑制肺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的效果與抑制增殖被逆轉(zhuǎn)。對照組、姜黃素誘導組、姜黃素誘導+HOTAIR 過表達組A549 細胞OD值分別為（0.57±0.06）、（0.14±0.05）和（0.53±0.07），3 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=101.300，P=0.000）。這一結果提示姜黃素抑制肺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是通過lncRNA HOTAIR 實現(xiàn)的。見圖5。

圖5 姜黃素通過HOTAIR抑制肺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

3 討論

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，目前肺癌的治療水平不斷提高，但患者的病死率仍居高不下，其中一個重要的因素是多數(shù)患者在晚期發(fā)生遠處器官轉(zhuǎn)移，使得多種治療手段無法取得有效的治療效果[14]。因此，抑制肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是提高患者生存率的有效方法之一。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是在病理條件或生理狀態(tài)下，細胞上皮特性減弱，同時獲得間質(zhì)特性。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象存在于胚胎發(fā)育過程中，研究證實上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是胚胎成熟必不可少的過程[14]。隨著對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化認識的深入，越來越多的證據(jù)顯示，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中同樣發(fā)揮不可或缺的作用[15-16]。目前，以上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程為靶點，抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為腫瘤治療研究的重要方向。但是，在治療過程中所使用的傳統(tǒng)化療藥物常常伴隨不良反應，而且長期使用導致耐藥的發(fā)生也是臨床常見的問題[17]。由于這些限制，國內(nèi)外抗癌藥物的研發(fā)逐漸將目光轉(zhuǎn)向天然植物，中藥治療成為腫瘤治療領域新興的熱點。姜黃素是在植物中提取的化學成分，具有較低的毒副作用，尤其是姜黃素對腫瘤細胞具有抑制作用，而對正常細胞無明顯的細胞毒性作用。既往研究證實，姜黃素在多種腫瘤中都體現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果[18]。姜黃素被認為是最有可能被開發(fā)成為現(xiàn)代天然藥用化合物之一[19]。姜黃素在多種腫瘤中不僅具有抑制腫瘤增殖、促進腫瘤細胞凋亡的作用，同時具有抑制腫瘤向遠處轉(zhuǎn)移的作用。本研究CCK-8 實驗明確姜黃素對肺癌細胞的抑制作用，同時發(fā)現(xiàn)25 μmol/L 濃度的姜黃素能有效抑制細胞的增殖，故將25 μmol/L 選做本實驗的使用濃度。本研究通過Transwell 實驗證實姜黃素能夠抑制肺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，Western blotting 檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標志蛋白發(fā)現(xiàn)，姜黃素在抑制肺癌細胞侵襲和遷移的同時抑制了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移的早期有重要的意義，腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生使得腫瘤細胞遷移能力增強，更容易發(fā)生腫瘤早期轉(zhuǎn)移[20]。通過姜黃素治療，肺癌細胞的侵襲和遷移能力受到抑制，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化被逆轉(zhuǎn)，說明姜黃素不僅對肺癌細胞快速增殖有抑制作用，同時對肺癌細胞的侵襲和遷移也有明顯抑制作用。既往研究證實，姜黃素對腫瘤發(fā)揮抑制作用的機制，不僅有經(jīng)典通路的參與，同時lncRNA 的表達改變也是姜黃素發(fā)揮作用的重要機制[21]。lncRNA 不編碼蛋白，在體內(nèi)的病理生理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[22-23]。本研究結果證實肺癌患者組織中HOTAIR 的表達顯著升高，HOTAIR 的表達與患者的TNM 分期、分化程度、淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關，與患者年齡、性別無關。本研究測序發(fā)現(xiàn)姜黃素誘導后肺癌細胞中的lncRNAs 改變顯著，尤其是lncRNA HOTAIR。通過qRT-PCR 進一步驗證了姜黃素對lncRNA HOTAIR 表達調(diào)控最為明顯。HOTAIR是第一個被發(fā)現(xiàn)具有反式作用的lncRNA。人類HOTAIR 在染色體12q13 區(qū)域，由5 個短外顯子和1 個長外顯子共同組成。研究證實[24]，HOTAIR 在腫瘤原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的表達較正常組織高200～2 000 倍，提示HOTAIR 在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本研究中發(fā)現(xiàn)姜黃素抑制HOTAIR 的表達，提示姜黃素抑制肺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移是通過HOTAIR 實現(xiàn)的。進一步在細胞中過表達HOTAIR 后再給予姜黃素，姜黃素對肺癌細胞的抑制作用被逆轉(zhuǎn)，證實姜黃素抑制肺癌細胞增殖，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是通過HOTAIR 實現(xiàn)的。這些結果提示HOTAIR 參與了肺癌的進展。本研究結果與LIU等[25]的研究結果一致。

綜上所述，本研究證實姜黃素不僅能夠抑制肺癌細胞增殖，還能顯著抑制侵襲和轉(zhuǎn)移，以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。同時本研究還證實姜黃素抑制肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是通過lncRNA HOTAIR 實現(xiàn)的。