CIDEA基因上游調(diào)控區(qū)變異對豬肌內(nèi)脂肪性狀的影響

楊凱,魏雨辰,吳望軍,鈕瑩芳,邱啟勇,邵勇鋼,翟曼君,董新星,韋偉,陳杰,張立凡*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052; 3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650201)

誘導(dǎo)細(xì)胞死亡DNA片段化因子α樣效應(yīng)因子A(cell death-inducing DNA fragmentation factor α-like effector A,CIDEA)基因是一類誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子,它也具有調(diào)控脂質(zhì)代謝的作用[1]。以往的研究顯示CIDEA在小鼠棕色脂肪組織中高表達(dá),敲除CIDEA后小鼠的產(chǎn)熱和脂肪分解增多,機(jī)體變瘦,其原因是CIDEA能夠通過抑制解偶聯(lián)蛋白1(UCP1)的活性來調(diào)節(jié)棕色脂肪組織中的脂質(zhì)代謝,因此CIDEA基因也被認(rèn)為是棕色脂肪的標(biāo)志基因之一[2-3]。而與人相關(guān)的研究則表明CIDEA主要存在于白色脂肪組織中,其主要作用是促進(jìn)脂滴形成和調(diào)節(jié)肥胖者的胰島素抵抗[4-6]。目前,從對豬的相關(guān)研究中也發(fā)現(xiàn),CIDEA基因在白色脂肪組織中高表達(dá),肥胖型豬脂肪組織的CIDEA基因表達(dá)量要顯著高于瘦肉型豬[7-8],說明CIDEA基因在豬的脂質(zhì)沉積中也可能發(fā)揮著重要作用。

作為豬脂肪組織的一種,肌內(nèi)脂肪(IMF)位于肌肉纖維周圍及筋膜內(nèi)部,主要以大理石花紋在肌肉中呈現(xiàn)[9]。由于肌內(nèi)脂肪含量的高低與豬肉品質(zhì)呈正相關(guān)[10],對其形成機(jī)制的解析一直以來都是豬育種學(xué)家的核心研究內(nèi)容之一。進(jìn)入21世紀(jì)后,與豬肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的基因和標(biāo)記不斷被發(fā)現(xiàn),例如脂肪酸結(jié)合蛋白基因(FABP)[11-12]和鏈酰基輔酶A脫氫酶基因(ACADM)[13],這些基因可以為豬肌內(nèi)脂肪性狀的標(biāo)記輔助選擇提供可用的基礎(chǔ)資源,進(jìn)而為加快豬肉品質(zhì)的遺傳改良提供新途徑。CIDEA基因作為可能影響豬脂肪沉積的重要候選基因,而且最近的轉(zhuǎn)錄組研究也顯示CIDEA可以作為影響豬肌內(nèi)脂肪含量的潛在基因[14],關(guān)于其如何影響豬的肌內(nèi)脂肪沉積我們卻知之甚少。因此,本研究擬通過分析豬CIDEA基因上游調(diào)控區(qū)的突變與其mRNA表達(dá)水平、轉(zhuǎn)錄活性以及豬肌內(nèi)脂肪含量之間的相關(guān)性,來獲取CIDEA基因的變異與豬肌內(nèi)脂肪沉積之間的關(guān)聯(lián),為進(jìn)一步揭示CIDEA基因?qū)ωi肌內(nèi)脂肪的調(diào)控途徑,以及后續(xù)應(yīng)用CIDEA基因標(biāo)記對豬肌內(nèi)脂肪性狀進(jìn)行分子改良提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物來自常州市康樂農(nóng)牧有限公司的杜洛克×長白×大白三元雜交豬群體(n=263)。肌內(nèi)脂肪含量的測定采用索氏抽提法,參考《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定:GB 5009.6—2016》,使用乙醚抽提單塊肌肉樣品中的肌內(nèi)脂肪。在胴體重近似的個體中選取肌內(nèi)脂肪含量高、低組各26個個體,其中高組的肌內(nèi)脂肪含量為(4.358±0.225)%,低組的肌內(nèi)脂肪含量則為(2.259±0.088)%。

1.2 總RNA提取與實時熒光定量PCR(qPCR)

取個體的背最長肌組織置于2 mL離心管內(nèi),使用Trizol提取試劑盒(艾科瑞生物,湖南)提取組織的總RNA,之后用5×PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(TaKaRa,大連)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的CIDEA、FABP4和FABP3的mRNA序列,使用Primer 5.0軟件設(shè)計引物(表1)。qPCR使用Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒(翊圣生物,上海),在StepOne Plus qPCR儀(ABI,美國)上進(jìn)行試驗。采用20 μL反應(yīng)體系:SYBR Green Master Mix 10 μL,上、下游引物各0.4 μL,滅菌的DEPC水 7.2 μL,cDNA模板 2 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,40個循環(huán)。每個樣本重復(fù)3次,以酸性核糖體磷蛋白大亞基(ribosomal protein lateral stalk subunit P0,RPLP0)基因為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達(dá)量。

表1 實時熒光定量PCR(qPCR)及CIDEA調(diào)控區(qū)擴(kuò)增引物Table 1 Primer sequences for real-time quantitative PCR(qPCR)and the regulation region of CIDEA

1.3 DNA提取與PCR擴(kuò)增

剪出黃豆粒大小的背最長肌組織樣置于2 mL離心管中,用經(jīng)典的酚氯仿抽提法提取組織的DNA。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的豬CIDEA序列(NC_010448.4),找到上游調(diào)控區(qū)2 kb片段,使用Primer Premier 5.0軟件分段設(shè)計引物(表1)。之后對CIDEA上游調(diào)控區(qū)2 kb片段進(jìn)行擴(kuò)增,將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳試驗,符合目的片段長度且豐度高的單個條帶樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.4 序列比對及連鎖不平衡分析

測序得到的文件用DNAstar 7.1軟件進(jìn)行查看和比對,統(tǒng)計每個個體的基因型信息。多個位點(diǎn)間的連鎖不平衡使用HaploView 4.2軟件進(jìn)行分析。

1.5 構(gòu)建熒光素酶報告載體

在豬CIDEA基因g.97268816 T>A位點(diǎn)前后各250 bp設(shè)計引物,將PGL3-basic作為報告載體,根據(jù)PGL3-basic載體上的多克隆酶切位點(diǎn)信息,分別在引物上、下游5′端加上KpnⅠ和Hind Ⅲ 2個限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。挑選不同基因型個體的DNA作為模板,使用T3酶擴(kuò)增目的片段,膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物并與PGL3-basic載體通過KpnⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切,用T4連接酶對酶切產(chǎn)物連接,然后將目的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,置于37 ℃搖床上培養(yǎng),待長出單克隆菌落后挑取單個菌落,測序確認(rèn)。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶報告基因活性檢測

參考尹杭等[15]的方法,首先將實驗室保存的HEK 293T細(xì)胞系(翼飛雪生物,南京)置于37 ℃水浴中復(fù)蘇,離心后棄凍存液,然后加入DMEM高糖培養(yǎng)基,輕輕吹打使細(xì)胞懸浮,最后將其接種到T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時,加入胰蛋白酶使細(xì)胞充分消化,約2 min后,加入等量DMEM高糖培養(yǎng)基終止消化,然后將細(xì)胞全部轉(zhuǎn)移至15 mL離心管,1 000 r·min-1離心5 min,棄上清液后加入DMEM高糖培養(yǎng)基,吹打均勻,均勻接種至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待細(xì)胞量長滿約80%時,將g.97268816 T>A位點(diǎn)的TT型、AA型和PGL3-basic空載等3種雙熒光素酶報告載體,分別與內(nèi)參質(zhì)粒海腎熒光素酶報告載體(pRL-TK)用Lipofectamine 3000(Invitrogen,上海)轉(zhuǎn)染試劑瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞系,24 h后用裂解液收集細(xì)胞,混和均勻后加至1.5 mL離心管,10 000 r·min-1離心1 min,取上清液,用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega,美國)和酶標(biāo)儀(Bio-Tek,美國)檢測熒火蟲熒光素酶活性,用pRL-TK質(zhì)粒產(chǎn)生的海腎熒光素酶活性進(jìn)行矯正,計算雙熒光素酶報告載體的啟動子區(qū)活性值。

1.7 統(tǒng)計分析

運(yùn)用SPSS 25.0軟件對CIDEA基因突變與肌內(nèi)脂肪含量之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行分析。線性模型如下:Yijk=μ+Wi+Gj+Sk+eijk。其中,Yijk為肌內(nèi)脂肪含量表型值;μ為總體平均數(shù);Wi為胴體重,設(shè)為協(xié)變量;Gj為基因型效應(yīng),Sk為性別,Gj和Sk設(shè)為固定效應(yīng);eijk為殘差效應(yīng)。使用Bonferroni多重比較法對不同基因型間的差異進(jìn)行比較。此外,使用配對t檢驗分析2組之間的差異,用單因素方差分析法分析不同基因型個體的mRNA表達(dá)水平差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 CIDEA基因的表達(dá)及上游調(diào)控區(qū)的變異分析

如圖1-A所示:本試驗構(gòu)建的肌內(nèi)脂肪高低組群體之間的肌內(nèi)脂肪含量差異極顯著(P<0.01),qPCR檢測發(fā)現(xiàn)CIDEA基因在豬肌內(nèi)脂肪含量高、低組群體中的mRNA表達(dá)水平也差異極顯著(P<0.01)(圖1-B)。利用DNAstar 7.1軟件對CIDEA基因上游調(diào)控區(qū)約2 kb的序列測序后進(jìn)行比對,結(jié)果顯示在肌內(nèi)脂肪高、低組群體中共存在6個SNP位點(diǎn)(圖1-C),這些位點(diǎn)在肌內(nèi)脂肪含量高低組的基因頻率均差異極顯著(P<0.01)(表2)。鑒于標(biāo)簽SNP是通過連鎖不平衡確定的少數(shù)能夠代表感興趣基因組區(qū)域內(nèi)的所有SNP,并且彼此之間盡可能相互獨(dú)立的SNP位點(diǎn)[16],因此對上述6個SNP位點(diǎn)做連鎖不平衡分析,發(fā)現(xiàn)g.97268816 T>A和g.97269217 G>A之間,以及它們與其他位點(diǎn)之間處于連鎖平衡狀態(tài),而g.97269280 A>G、g.97269353 C>T、g.97269420 T>C和g.97269575 G>A這4個位點(diǎn)相互之間處于連鎖不平衡狀態(tài)(圖1-D)。因此,本研究選取了g.97268816 T>A、g.97269217 G>A和g.97269353 C>T 3個標(biāo)簽SNP位點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)的分析。

圖1 CIDEA的表達(dá)及上游調(diào)控區(qū)變異分析Fig.1 CIDEA expression and variation analysis of its upstream regulatory region 1)A. 肌內(nèi)脂肪含量高(HG)、低(LG)組群體;B. CIDEA基因在肌內(nèi)脂肪含量高組和低組中的表達(dá)差異;C. 6個突變位點(diǎn)雜合子的測序圖譜(框內(nèi)為SNP位點(diǎn)位置);D. CIDEA基因突變位點(diǎn)的連鎖不平衡分析(以R2值來代表2個位點(diǎn)間的連鎖不平衡程度)。2)組間不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。1)A. Intramuscular fat contents in high(HG)and low(LG)groups;B. The difference expression of CIDEA gene in high and low intramuscular fat content groups;C. Sequence map of heterozygotes at six mutation loci(SNP locus was in box);D. Linkage disequilibrium analysis of CIDEA gene mutations(The R2 value represents the degree of linkage disequilibrium between these loci). 2)The different capital letters between groups indicate highly significant difference(P<0.01).

表2 CIDEA基因SNP位點(diǎn)在肌內(nèi)脂肪含量高、低組中的基因頻率Table 2 The allele frequency of SNP loci in CIDEA gene between high and low intramuscular fat content groups

2.2 g.97268816 T>A、g.97269217 G>A和g.97269353 C>T位點(diǎn)與豬肌內(nèi)脂肪含量的關(guān)聯(lián)分析

進(jìn)一步在雜交豬群體中擴(kuò)大樣本量對g.97268816 T>A、g.97269217 G>A和g.97269353 C>T這3個SNP位點(diǎn)與肌內(nèi)脂肪含量的關(guān)系進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)g.97268816 T>A位點(diǎn)不同基因型個體的肌內(nèi)脂肪含量之間存在顯著差異,其中AA基因型個體的肌內(nèi)脂肪含量顯著高于TT基因型個體(P<0.05),而TA基因型個體較TT基因型個體的肌內(nèi)脂肪含量高0.37,但兩者之間沒有達(dá)到顯著差異。g.97269217 G>A和g.97269353 C>T位點(diǎn)中不同基因型個體的肌內(nèi)脂肪含量差異均不顯著(P>0.05)(表3)。

表3 g.97268816 T>A、g.97269217 G>A和g.97269353 C>T位點(diǎn)與豬肌內(nèi)脂肪含量的關(guān)聯(lián)分析Table 3 Association analysis of g.97268816 T>A,g.97269217 G>A and g.97269353 C>T loci with intramuscular fat(IMF)contents of pigs

2.3 CIDEA基因和肌內(nèi)脂肪標(biāo)記基因在g.97268816 T>A位點(diǎn)不同基因型個體的表達(dá)分析

檢測g.97268816 T>A不同基因型個體CIDEA基因mRNA表達(dá),結(jié)果(圖2)顯示:AA基因型個體的表達(dá)水平顯著高于TT基因型個體(P<0.05),AA基因型FABP4基因表達(dá)水平極顯著高于TT基因型個體(P<0.01),且顯著高于TA基因型個體(P<0.05),不同基因型個體間的FABP3表達(dá)水平則未見顯著變化(P>0.05)。

圖2 CIDEA基因和肌內(nèi)脂肪標(biāo)記基因FABP4、FABP3在g.97268816 T>A 位點(diǎn)不同基因型個體中的表達(dá)Fig.2 The expression of CIDEA gene and intramuscular fat marker genes FABP4,FABP3 among different genotype individuals at g.97268816 T>A locus 每個群體7個樣本。不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Each group contains seven samples. The different capital letters among different genotype groups mean highly significant difference(P<0.01),whereas the different lowercase letters among different genotype groups mean significant difference(P<0.05). The same below.

2.4 CIDEA基因g.97268816 T>A位點(diǎn)不同基因型啟動子活性分析

將空載體pGL3-basic和構(gòu)建好的載體pGL3-T、pGL3-A分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,檢測熒光素酶活性。結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn),與空載相比,pGL3-T和pGL3-A載體的熒光素酶活性均極顯著升高(P<0.01),同時pGL3-A載體的熒光素酶活性極顯著高于pGL3-T載體(P<0.01),說明AA型CIDEA基因的熒光素酶活性高于TT型,這與AA型豬個體的CIDEA基因表達(dá)量和肌內(nèi)脂肪含量都顯著高于TT型個體的結(jié)果一致(表3)。

圖3 豬CIDEA雙熒光素酶報告載體構(gòu)建(A)及g.97268816 T>A突變不同基因型載體啟動子活性分析(B)Fig.3 Construction of dual-luciferase reporter system(A)and analysis of promoter activity of g.97268816 T>A mutant with different genotypes vectors(B)

2.5 CIDEA基因g.97268816 T>A轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測

運(yùn)用JASPER在線網(wǎng)站對豬g.97268816 T>A突變位點(diǎn)可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)突變后一共存在22個轉(zhuǎn)錄因子,其中有20個為突變后不結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,只有2個為突變后新出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子。評分排名前六的轉(zhuǎn)錄因子分別為腫瘤蛋白P73(TP73)、腫瘤蛋白P53(TP53)、E盒鋅指蛋白1(ZEB1)、芳基烴受體核傳遞器樣分子(ARNTL)、上游刺激因子1(USF1)和MYC基因相關(guān)X因子(MAX)(表4)。

表4 CIDEA基因g.97268816 T>A突變的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合預(yù)測Table 4 Transcription factor binding prediction for g.97268816 T>A mutation of CIDEA gene

3 討論

作為影響脂肪組織形成和脂肪產(chǎn)熱相關(guān)的關(guān)鍵基因之一,CIDEA在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著極為重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)CIDEA可以控制脂滴的融合,對脂肪的儲存具有重要的作用[17],而敲除CIDEA會顯著提高人脂肪細(xì)胞的脂解作用,且CIDEA的表達(dá)可以正向調(diào)控胰島素敏感性[6]。這些研究表明CIDEA基因不僅能夠促進(jìn)脂滴融合,也可以改變胰島素敏感性,進(jìn)而降低能量消耗,抑制脂肪分解。

CIDEA在脂肪型肉雞的表達(dá)水平顯著高于瘦型肉雞[18],與肌內(nèi)脂肪性狀相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組或單基因的研究發(fā)現(xiàn)CIDEA基因的表達(dá)與豬、牛和羊等動物中肌內(nèi)脂肪的沉積呈正相關(guān)[13,19],說明CIDEA基因可能影響動物的肌內(nèi)脂肪沉積。然而,CIDEA基因如何影響豬的肌內(nèi)脂肪性狀至今我們依舊知之有限。本研究在發(fā)現(xiàn)CIDEA基因表達(dá)水平與豬肌內(nèi)脂肪含量的高低存在相關(guān)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步在CIDEA基因上游調(diào)控區(qū)發(fā)現(xiàn)g.97268816 T>A位點(diǎn)與豬肌內(nèi)脂肪含量存在顯著關(guān)聯(lián),其AA基因型個體的肌內(nèi)脂肪含量、CIDEA基因和肌內(nèi)脂肪沉積標(biāo)記基因FABP4的表達(dá)水平均顯著高于TT基因型個體,這些結(jié)果暗示CIDEA基因的g.97268816 T>A變異對豬的肌內(nèi)脂肪沉積存在顯著影響,而且其很有可能是通過FABP4基因來實現(xiàn)上述影響的,但對于2個基因之間是否存在相互作用還需要進(jìn)一步驗證。上述結(jié)果從不同層面證實了CIDEA基因能夠影響豬的肌內(nèi)脂肪沉積。

我們進(jìn)一步推測g.97268816 T>A位點(diǎn)突變后造成肌內(nèi)脂肪含量增加的原因可能是突變后造成其轉(zhuǎn)錄活性發(fā)生變化,使得CIDEA基因mRNA表達(dá)水平提高,增加了肌內(nèi)脂肪的沉積。本研究驗證了g.97268816 T>A位點(diǎn)的突變對轉(zhuǎn)錄活性的影響,發(fā)現(xiàn)AA型的轉(zhuǎn)錄活性極顯著高于TT型,說明該位點(diǎn)突變后CIDEA基因的轉(zhuǎn)錄活性顯著升高,因此我們認(rèn)為這其中轉(zhuǎn)錄因子可能發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)CIDEA的轉(zhuǎn)錄依賴于PGC1α的激活,同時受到PPAR激動劑的影響[20];小鼠CIDEA基因啟動子區(qū)存在SREBP1的結(jié)合元件,SREBP1的結(jié)合會激活CIDEA的轉(zhuǎn)錄,而且CIDEA會對SREBP1c的某些靶基因的轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生影響[21],這些結(jié)果說明轉(zhuǎn)錄因子可以通過結(jié)合CIDEA基因的上游調(diào)控區(qū)來影響其對于脂肪代謝的調(diào)控。在本研究中鑒定的g.97268816 T>A突變位點(diǎn)上我們并沒有發(fā)現(xiàn)其結(jié)合元件中存在PGC1α和SREBP1等轉(zhuǎn)錄因子,但是突變也造成了多個其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合發(fā)生變化,比如與脂肪干細(xì)胞凋亡相關(guān)的TP53[22],與成脂相關(guān)的ZEB1[23],以及調(diào)控脂質(zhì)代謝的USF1[24],提示該位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子的不同結(jié)合狀態(tài)可能造成了CIDEA基因轉(zhuǎn)錄活性的升高。

目前對于豬CIDEA基因上游調(diào)控區(qū)突變位點(diǎn)與脂肪性狀關(guān)聯(lián)的研究較少,從本研究的結(jié)果可以看出CIDEA基因上游調(diào)控區(qū)的g.97268816 T>A位點(diǎn)與豬肌內(nèi)脂肪沉積顯著關(guān)聯(lián),此突變可以正向調(diào)控基因的表達(dá),而這一作用可能受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,這些結(jié)果對于后續(xù)豬CIDEA的功能研究提供了基礎(chǔ)證據(jù),但是其如何通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來影響豬的肌內(nèi)脂肪沉積還需要進(jìn)一步研究。