梨STP基因家族鑒定及PbrSTP11調(diào)控梨花粉管生長(zhǎng)的功能分析

王丹琪,張皓,王鵬,張紹鈴,吳巨友

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/江蘇省梨工程研究中心,江蘇 南京 210095)

在高等植物的生長(zhǎng)發(fā)育中,糖既是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)又是信號(hào)分子[1]。模式植物擬南芥中已鑒定出14個(gè)單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sugar transporter protein,STP)基因,STP的主要作用是轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)外體的己糖[2]。其中,AtSTP1是一種高親和力的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)體,能夠運(yùn)輸除果糖外的己糖[3],參與了保衛(wèi)細(xì)胞的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)[4]。AtSTP2是花粉特有的高親和力的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體,主要負(fù)責(zé)在花粉成熟早期階段吸收胼胝質(zhì)降解產(chǎn)生的葡萄糖[5]。AtSTP4也是高親和力的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體,主要在根尖、花粉管和葉片中表達(dá),當(dāng)受到機(jī)械損傷或病原菌侵染時(shí)其表達(dá)量明顯上升[6]。另外3個(gè)己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtSTP6、AtSTP9和AtSTP11在花粉發(fā)育的不同階段中也有表達(dá)[7-9]。AtSTP6在花粉外壁形成和花粉粒完全發(fā)育階段表達(dá)[7],AtSTP9是目前已知唯一的葡萄糖特異單糖轉(zhuǎn)運(yùn)體[8],AtSTP11是花粉管特異表達(dá)的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)體[9]。AtSTP13也是高親和力己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體,該基因在花瓣維管組織中特異表達(dá)[10]。此外,在蘋(píng)果還發(fā)現(xiàn)MdSTP13a在山梨醇調(diào)控花粉管生長(zhǎng)的過(guò)程中同時(shí)吸收己糖和蔗糖,以促進(jìn)蘋(píng)果花粉管的生長(zhǎng)[11]。

梨(Pyrusbretschneideri)屬于薔薇科果樹(shù),分布區(qū)域廣,具有重要的經(jīng)濟(jì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。糖既是果實(shí)重要的品質(zhì)因子,也可以作為信號(hào)分子調(diào)控花粉管生長(zhǎng)等發(fā)育過(guò)程,但是目前糖調(diào)控梨花粉管生長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不清楚。隨著測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展,‘碭山酥梨’的全基因組測(cè)序已順利完成[12],這為在全基因組水平上研究基因功能提供了條件。本研究基于已公布的梨全基因組數(shù)據(jù),篩選出梨STP基因,并通過(guò)生物信息學(xué)分析以及定量分析研究梨STP基因在各組織和花粉不同發(fā)育階段的表達(dá)情況,闡述其蛋白的基本特性;分析梨PbrSTP11蛋白的亞細(xì)胞定位,利用反義寡聚脫氧核苷酸(as-ODN)技術(shù)抑制PbrSTP11基因表達(dá),驗(yàn)證其在花粉管生長(zhǎng)發(fā)育中的作用,為探明糖分進(jìn)入梨花粉管的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和調(diào)控生長(zhǎng)的功能特性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試?yán)嫫贩N為‘碭山酥梨’,種植于江蘇省徐州市豐縣果樹(shù)試驗(yàn)園。2018年3月,采集梨的根、莖、葉、果實(shí)、花粉和花柱,其中花粉采自大蕾期的梨花,收集花藥,室溫自然散粉后放于硫酸紙袋,埋于硅膠保持干燥,放置于-20 ℃保存,取下的花柱保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 花粉離體培養(yǎng)

將梨花粉從冰箱中取出,先在4 ℃解凍2 h,然后在室溫(25 ℃)環(huán)境下解凍2 h。將花粉加入液體培養(yǎng)基,在黑暗、25 ℃條件下振蕩培養(yǎng)。液體培養(yǎng)基為:5 mmol·L-1MES、440 mmol·L-1蔗糖、0.55 mmol·L-1Ca(NO3)2、1.60 mmol·L-1MgSO4、1.60 mmol·L-1H3BO3、1.00 mmol·L-1KNO3,溶解于蒸餾水后用0.1 mol·L-1Tris溶液調(diào)pH值至6.5。

1.3 梨STP基因家族篩選

從擬南芥在線信息資源庫(kù)(http://www.arabidopsis.org)下載14個(gè)STP蛋白序列作為參考序列,基于擬南芥STP基因家族的保守結(jié)構(gòu)域在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org)的Pfam號(hào)(PF00083),進(jìn)行Hidden Markov Model搜索,將所有收集到的候選STP基因家族序列在InterProScan5數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/)中進(jìn)行功能域注釋,剔除不含STP保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。最終將篩出的序列進(jìn)行MUSCLE比對(duì),利用MEGA7.0軟件基于鄰接法對(duì)梨中已篩出的蛋白與擬南芥14個(gè)STP蛋白一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),Bootstrap值設(shè)置為1 000。梨的基因組資源從網(wǎng)站(http://peargenome.njau.edu.cn)獲得。

1.4 梨STP基因家族生物信息學(xué)分析

利用GSDS 2.0網(wǎng)站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制基因結(jié)構(gòu)。通過(guò)MEME 5.0.4(http://meme-suite.org/)識(shí)別STP基因的保守蛋白基序,具體設(shè)置參數(shù)如下:motif個(gè)數(shù)15;最小motif寬度10個(gè)氨基酸;最大motif寬度100個(gè)氨基酸。通過(guò)梨全基因組數(shù)據(jù)獲得已篩出的STP家族基因在染色體上的位置。利用Protparam軟件(http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行氨基酸數(shù)、相對(duì)分子質(zhì)量、脂肪族氨基酸指數(shù)、理論等電點(diǎn)和蛋白質(zhì)疏水性的分析。亞細(xì)胞定位利用CELLO v.2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/cgi/main.cgi)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.5 梨STP基因定量表達(dá)分析

使用多糖多酚植物RNA提取試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司)提取RNA,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Transgene(TransScript Reverse Transcriptase,AT101-02)合成cDNA,使用RT-qPCR法分析PbrSTP基因的表達(dá)。設(shè)計(jì)目的基因特異引物,并使用NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)的Primer-blast工具檢測(cè)引物的特異性。以PbrUBQ為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCT法計(jì)算出目的基因相對(duì)表達(dá)量。RT-qPCR分析引物見(jiàn)表1。采用Excel 2007軟件繪制圖表和統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果均以3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

表1 試驗(yàn)所需引物及用途Table 1 Primers needed in the experiment and its application

1.6 不同糖種類和不同糖質(zhì)量濃度的處理

在梨花粉離體培養(yǎng)試驗(yàn)中,設(shè)置3種糖(蔗糖、葡萄糖和果糖)和不同糖質(zhì)量濃度(0、50、100、150、200 g·L-1)的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)花粉。這3種糖為培養(yǎng)基中支持花粉管生長(zhǎng)的唯一碳源,以探究不同糖和不同糖質(zhì)量濃度對(duì)梨花粉萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響。處理后,在梨花粉培養(yǎng)2 h時(shí)進(jìn)行拍照,以統(tǒng)計(jì)花粉的萌發(fā)率;當(dāng)梨花粉培養(yǎng)4 h進(jìn)行拍照,以統(tǒng)計(jì)花粉管的長(zhǎng)度。本試驗(yàn)使用配備有CCD照相機(jī)的DP80(奧林巴斯,日本)的Olympus IX73顯微鏡進(jìn)行拍照。利用Image J軟件(https://imagej.nih.gov/ij)統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度。此外,所有處理花粉收集后提取總RNA,利用熒光定量PCR檢測(cè)目的基因表達(dá)量。

1.7 PbrSTP11基因表達(dá)分析、基因克隆與蛋白亞細(xì)胞定位

為了驗(yàn)證梨花粉中STP蛋白的潛在功能,以不同發(fā)育階段‘碭山酥梨’花粉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[13]為基礎(chǔ),對(duì)35個(gè)PbrSTP基因進(jìn)行表達(dá)分析。

對(duì)花粉高表達(dá)的PbrSTP11進(jìn)行基因克隆和亞細(xì)胞定位試驗(yàn)。以‘碭山酥梨’花粉cDNA為模板用高保真聚合酶Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase(Vazyme,P505)對(duì)PbrSTP11基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,切取目的條帶,按DNA回收試劑盒(江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)回收純化目的片段DNA。對(duì)p1300-35S-GFP載體質(zhì)粒(TaKaRa)用XbaⅠ和BamHⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。載體質(zhì)粒酶切純化后,用重組連接酶(Vazyme)將目的基因和載體的酶切產(chǎn)物在37 ℃條件下連接0.5 h,轉(zhuǎn)化構(gòu)建載體。測(cè)序準(zhǔn)確構(gòu)建載體成功后,將PbrSTP11的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(GV3101)中,并在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。采用張皓等[14]的方法侵染煙草:將農(nóng)桿菌液按體積比1∶50的比例擴(kuò)繁后5 000 r·min-1離心10 min收集菌液,并將菌液懸浮在含有10 mmol·L-1MES、10 mmol·L-1MgCl2和100 μmol·L-1乙酰丁香酮的誘導(dǎo)劑中,置于室溫50 r·min-1的搖床中孵育4 h;用1 mL去針頭無(wú)菌注射器吸入菌液緩緩注射到小葉本氏煙草的葉片背面,侵染完成后放在20～25 ℃的環(huán)境下繼續(xù)生長(zhǎng)2 d,并使用ZEISS LSM800激光共聚焦顯微鏡拍照。試驗(yàn)重復(fù)3次。亞細(xì)胞定位引物見(jiàn)表1。

1.8 酵母功能驗(yàn)證

酵母感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化參照具體操作參照Clontech操作指南(Clontech Laboratories Inc.,USA)。將測(cè)序正確的PbrSTP11構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pYES 2.0上,并分別轉(zhuǎn)入糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白敲除的釀酒酵母突變體EBY.VW 4000(僅對(duì)麥芽糖有吸收能力)中。酵母轉(zhuǎn)化菌株在不同糖含量培養(yǎng)基上生長(zhǎng),以空載體pYES 2.0作為對(duì)照,調(diào)整SD/-Ura固體培養(yǎng)基中單糖底物質(zhì)量濃度為2 g·L-1,研究梨單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇4種單糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力及特殊性。具體操作如下:1)將轉(zhuǎn)化了梨PbrSTP基因的酵母菌株接種至5 mL SD/-Ura/麥芽糖液體培養(yǎng)基中,28 ℃、200 r·min-1搖菌,培養(yǎng)至D600值達(dá)到0.6左右;2)取1.5 mL酵母菌液置于2 mL離心管中,3 000g離心5 min后棄上清液,再加入1.5 mL的1×PBS緩沖液,4 000g離心5 min,重復(fù)3次;3)調(diào)整菌液D600至1.0,并按1∶10、1∶100和1∶1 000的體積比稀釋菌液;4)吸取原液和各稀釋液各5 μL至SD/-Ura/麥芽糖、SD/-Ura/葡萄糖、SD/-Ura/果糖、SD/-Ura/蔗糖、SD/-Ura/山梨醇固體培養(yǎng)基上,在28 ℃下倒置培養(yǎng)3～5 d后觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.9 反義寡聚脫氧核苷酸(as-ODN)技術(shù)處理

as-ODN引物序列的長(zhǎng)度為17～22 bp,GC含量為60%～65%,以保證合適的解鏈溫度。每個(gè)基因設(shè)計(jì)5條as-ODN序列,以不與基因組任何序列完全互補(bǔ)的正義寡聚脫氧核苷酸(sense oligo nucleotide,s-ODN)序列為對(duì)照。首先將花粉在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)40 min,取200 μL至離心管中,用合成好的as-ODN序列按5、10、20、30、40 mmol·L-1濃度梯度加入轉(zhuǎn)染試劑并在25 ℃培養(yǎng)箱中孵育15 min,轉(zhuǎn)染試劑終質(zhì)量濃度為15 μg·mL-1,然后加入梨花粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h后,取樣觀察并統(tǒng)計(jì)。收集處理后的花粉并提取RNA,利用熒光定量PCR檢測(cè)目的基因表達(dá)量,篩選出效果最佳的as-ODN引物序列(表1),并通過(guò)觀察花粉管生長(zhǎng)情況,篩選出最佳引物濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 梨STP基因家族鑒定及基本信息分析

通過(guò)對(duì)梨基因組數(shù)據(jù)的篩選,最終獲得35個(gè)STP基因,分別命名為PbrSTP1—PbrSTP35,其基本信息如表2所示。根據(jù)梨染色體基因組信息,分析35個(gè)STP基因在染色體上的分布情況,發(fā)現(xiàn)有32個(gè)基因不均勻地分布在染色體上,3個(gè)基因分布在scaffold上。分布基因最多的染色體為Chr16,分布有11個(gè)基因;其次是Chr2、Chr12和Chr13,各分布4個(gè);Chr15分布3個(gè),Chr1和Chr5各分布2個(gè),Chr4和Chr8各分布1個(gè)。STP蛋白平均長(zhǎng)度約為482個(gè)氨基酸,其中PbrSTP29最長(zhǎng)為602個(gè)氨基酸,而PbrSTP3最短為273個(gè)氨基酸。

表2 梨STP基因基本信息Table 2 Basic information of STP genes in pear

續(xù)表2 Table 2 continued

2.2 梨STP基因家族系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)保守功能域分析

將梨中35個(gè)PbrSTP基因與擬南芥中14個(gè)AtSTP基因編碼的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果(圖1-A)顯示,梨STP基因家族分為5個(gè)亞家族,各家族的序列具有高度保守性,大部分序列的同源性達(dá)90%以上。梨STP基因CDS序列平均長(zhǎng)度為1 536 bp左右,其中PbrSTP13(2 131 bp)基因序列最長(zhǎng),PbrSTP3(819 bp)序列最短。對(duì)梨STP的編碼區(qū)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果(圖1-B)發(fā)現(xiàn)STP家族基因的外顯子數(shù)為 1～8個(gè),其中,PbrSTP29含有8個(gè),而PbrSTP3和PbrSTP4只有1個(gè),表明STP基因家族在進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)了外顯子增加或者缺失現(xiàn)象。

對(duì)梨STP基因家族成員的蛋白序列分析發(fā)現(xiàn),梨STP蛋白的motif與擬南芥的高度一致,其中 motif 1—motif 11是高度保守的結(jié)構(gòu)(圖1-C),絕大多數(shù)梨STP基因中均含有這11個(gè)motif,進(jìn)一步說(shuō)明STP基因在進(jìn)化過(guò)程中的相對(duì)保守性。

圖1 擬南芥和梨STP基因家族系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(A)、基因結(jié)構(gòu)(B)及蛋白motif分析(C)Fig.1 Phylogenetic relationship(A),gene structure(B)and protein motif analysis(C)of STP genes family in Arabidopsis thaliana and pear

2.3 梨STP基因家族的基本理化性質(zhì)分析

對(duì)35個(gè)PbrSTP基因的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析,結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)PbrSTP蛋白平均相對(duì)分子質(zhì)量為(29.88～65.26)×103;理論等電點(diǎn)(pI)為8.54～9.83,蛋白質(zhì)呈堿性;不穩(wěn)定指數(shù)為29.22～45.42,脂肪族指數(shù)為98.49～114.93;最大疏水系數(shù)為0.20～0.64,均為疏水性蛋白(最大疏水系數(shù)>0)。另外,利用CELLO v.2.5網(wǎng)站對(duì)這些基因的蛋白序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)其均定位于細(xì)胞質(zhì)膜上。

表3 梨STP基因家族基本特性Table 3 Basic characteristics of the STP gene families in pear

2.4 梨PbrSTP基因家族成員表達(dá)模式分析

對(duì)35個(gè)PbrSTP在不同發(fā)育階段‘碭山酥梨’花粉中的表達(dá)進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有17個(gè)PbrSTP基因在花粉中沒(méi)有表達(dá),而其余18個(gè)基因的表達(dá)如圖2所示。PbrSTP9、PbrSTP10、PbrSTP15、PbrSTP16、PbrSTP17、PbrSTP22和PbrSTP26的表達(dá)量從水合花粉粒(HP)到停止生長(zhǎng)的花粉管(SPT)過(guò)程中逐漸降低,而其他STP基因在梨花粉管發(fā)育過(guò)程中表達(dá)趨勢(shì)并不明顯。其中PbrSTP11從HP到正常生長(zhǎng)的花粉管(PT)中的表達(dá)量比其他PbrSTP基因更高,甚至在SPT中還保持相對(duì)較高的表達(dá)量,表明其在花粉生長(zhǎng)中可能具有重要的功能。

圖2 ‘碭山酥梨’花粉STP家族基因表達(dá)水平Fig.2 Expression level of STP gene families of‘Dangshansuli’pear pollen MP:花粉粒;HP:水合花粉粒;PT:生長(zhǎng)的花粉管;SPT:停止生長(zhǎng)的花粉管。紅色代表高表達(dá),白色代表低表達(dá)。MP:Pollen grain;HP:Hydrated pollen grains;PT:Growing pollen tube;SPT:Stop growing pollen tube. Red indicated low expression and white indicated high expression.

2.5 PbrSTP11基因在不同糖種類和不同質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基中花粉的萌發(fā)率以及不同組織中的表達(dá)分析

由圖3可見(jiàn):在含蔗糖的培養(yǎng)基中,無(wú)論是花粉萌發(fā)率還是花粉管長(zhǎng)度都顯著高于含果糖、葡萄糖或不含糖的培養(yǎng)基。與無(wú)糖培養(yǎng)基相比,含糖培養(yǎng)基能夠促進(jìn)花粉萌發(fā),隨著糖質(zhì)量濃度的升高花粉萌發(fā)率呈先升高后降低的趨勢(shì),高質(zhì)量濃度(200 g·L-1)的果糖和葡萄糖對(duì)花粉萌發(fā)抑制明顯。與無(wú)糖的培養(yǎng)基相比,含糖培養(yǎng)基均能夠促進(jìn)花粉管生長(zhǎng);低質(zhì)量濃度的果糖和葡萄糖對(duì)花粉管生長(zhǎng)的促進(jìn)作用沒(méi)有蔗糖顯著。隨著單糖質(zhì)量濃度的升高,花粉管長(zhǎng)度沒(méi)有明顯變化,高質(zhì)量濃度的單糖顯著抑制花粉管生長(zhǎng)。

圖3 花粉在蔗糖、葡萄糖和果糖培養(yǎng)基中萌發(fā)率(A)和花粉管長(zhǎng)度(B)Fig.3 Pollen germination rate(A)and the length of pollen tube(B)in the media with sucrose,glucose and fructose不同小寫(xiě)字母表示不同處理間在0.05水平上差異顯著,下同。Different letters above each bar indicate significant difference at 0.05 level among different treatments. The same below.

由圖4可見(jiàn):不同質(zhì)量濃度蔗糖對(duì)PbrSTP11表達(dá)量有影響但差異不顯著;在葡萄糖和果糖的培養(yǎng)基中,隨著單糖質(zhì)量濃度升高,PbrSTP11表達(dá)量顯著升高,表明高質(zhì)量濃度的單糖促進(jìn)PbrSTP11基因表達(dá)。此外,通過(guò)對(duì)PbrSTP11基因在梨的根、莖、葉、果實(shí)、子房、花柱和花粉等組織中的RT-qPCR分析,發(fā)現(xiàn)PbrSTP11在花粉中表達(dá)量高,而在其他組織中幾乎不表達(dá)。

圖4 PbrSTP11基因在不同培養(yǎng)基(A)和組織(B)中的表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of PbrSTP11 gene in different medium(A)and tissues(B)

2.6 PbrSTP11蛋白的亞細(xì)胞定位和功能分析

如圖5所示:綠色熒光蛋白(GFP)空載在煙草葉片的細(xì)胞中均有表達(dá);而PbrSTP11的綠色熒光主要定位在細(xì)胞膜上,說(shuō)明PbrSTP11為細(xì)胞膜蛋白,這與CELLO v.2.5網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖5 PbrSTP11蛋白的亞細(xì)胞定位(標(biāo)尺=20 μm)Fig.5 Subcellular localizations of PbrSTP11 protein(Bars=20 μm)

由圖6可見(jiàn):轉(zhuǎn)化空載pYES 2.0酵母菌株EBY.VW 4000只能在含有麥芽糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng),而在其他碳源培養(yǎng)基上均呈現(xiàn)透明菌斑,但未生長(zhǎng);在含有20 g·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基上,轉(zhuǎn)入PbrSTP11基因的酵母菌斑長(zhǎng)勢(shì)很旺,在20 g·L-1果糖的培養(yǎng)基上酵母長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)于葡萄糖培養(yǎng)基上的長(zhǎng)勢(shì)稍弱,100倍和1 000倍稀釋菌液較明顯;在含有20 g·L-1蔗糖和20 g·L-1山梨醇的培養(yǎng)基上,未觀察到轉(zhuǎn)入PbrSTP11基因的菌斑生長(zhǎng)。綜上所述,含有PbrSTP11蛋白的酵母菌株對(duì)不同糖的吸收能力由大到小依次為:葡萄糖、果糖、蔗糖/山梨醇,表明PbrSTP11蛋白對(duì)單糖具有轉(zhuǎn)運(yùn)能力,但不能轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖和山梨醇。

圖6 PbrSTP11蛋白在酵母突變體EBY.VW 4000中的功能驗(yàn)證Fig.6 Functional verification of PbrSTP11 in yeast mutant EBY.VW 4000酵母菌斑在每種培養(yǎng)基上從左至右分別為稀釋1倍、10倍、100倍和1 000倍。Yeast plaques were diluted 1-fold,10-fold,100-fold,and 1 000-fold from left to right on each medium.

圖7 敲低PbrSTP11表達(dá)抑制梨花粉管生長(zhǎng)Fig.7 Knocking-down PbrSTP11 expression inhibited pollen tube growth A. RT-qPCR檢測(cè)PbrSTP11基因的表達(dá)Expression level of PbrSTP11 detected by RT-qPCR;B. as-ODN處理后花粉管長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì) Statistical analysis of the pollen tube length after as-ODN treatment;C. as-ODN處理對(duì)花粉管生長(zhǎng)的影響 The effect of as-ODN treatment on the growth of pollen tube.**P<0.01. Bar=200 μm.

由圖7可見(jiàn):as-ODN處理可以顯著抑制花粉PbrSTP11的表達(dá),當(dāng)PbrSTP11表達(dá)下調(diào)后,花粉管的長(zhǎng)度明顯變短,表明降低PbrSTP11的表達(dá)量抑制了梨花粉管生長(zhǎng)。

3 討論

STP屬于單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(monosaccharide transporter,MST)成員,廣泛存在于植物中[1-2,15]。本研究共鑒定出35個(gè)梨STP基因,其特性與已報(bào)道的擬南芥STP基因高度相似[1]。通過(guò)亞細(xì)胞定位軟件預(yù)測(cè)梨PbrSTP均定位在細(xì)胞膜上,亞細(xì)胞定位試驗(yàn)也表明PbrSTP11定位于細(xì)胞膜,這與Zhang等[16]的研究結(jié)果一致,表明PbrSTP是一種膜蛋白。

花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)是植物生殖發(fā)育的重要過(guò)程[17],但是花粉無(wú)法進(jìn)行光合作用并且是共質(zhì)體分離,因此在花粉管生長(zhǎng)過(guò)程中碳水化合物必須從雌蕊周?chē)慕M織輸入[8-9]。在離體培養(yǎng)中,蔗糖是花粉萌發(fā)和生長(zhǎng)所必需的,目前已在生長(zhǎng)的花粉中鑒定出蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)體[18-19]。Ylstra等[20]研究發(fā)現(xiàn)矮牽?；ǚ勰軐⑴囵B(yǎng)基中的蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖,表明花粉細(xì)胞壁中具有糖轉(zhuǎn)化酶的活性,同時(shí)也表明花粉管可以吸收單糖。因此探討單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在花粉萌發(fā)和生長(zhǎng)中的作用至關(guān)重要。本試驗(yàn)利用不同糖種類和濃度培養(yǎng)花粉,發(fā)現(xiàn)含蔗糖的培養(yǎng)基中花粉萌發(fā)率和生長(zhǎng)速率都顯著高于含果糖、葡萄糖以及不含糖的培養(yǎng)基。同時(shí),高質(zhì)量濃度的葡萄糖和果糖抑制了花粉萌發(fā),說(shuō)明不同糖種類對(duì)于梨花粉的萌發(fā)和生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制不同,對(duì)于其生長(zhǎng)發(fā)育的穩(wěn)態(tài)調(diào)控至關(guān)重要。

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)有效評(píng)估了擬南芥花粉發(fā)育過(guò)程中不同STP基因的表達(dá)模式,AtSTP2、AtSTP4、AtSTP6、AtSTP9、AtSTP10、AtSTP11在擬南芥花粉發(fā)育過(guò)程中有表達(dá),其中AtSTP2在小配子體發(fā)育早期表達(dá),而AtSTP4、AtSTP6、AtSTP9和AtSTP11則在花粉成熟過(guò)程中積累,在萌發(fā)花粉和生長(zhǎng)花粉管中,AtSTP11的表達(dá)最顯著,AtSTP4和AtSTP10的表達(dá)水平雖低,但也同樣顯著[2,21-23]。本研究根據(jù)梨花粉不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)有18個(gè)PbrSTP基因在花粉中表達(dá),其中PbrSTP11(AtSTP11的同源基因)在花粉生長(zhǎng)的不同階段都具有較高的表達(dá)水平,同時(shí)RT-qPCR也證實(shí)了PbrSTP11在花粉中特異性表達(dá),這與AtSTP11只在成熟的花粉和花粉管中表達(dá)相一致[9]。通過(guò)酵母功能互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)PbrSTP11對(duì)葡萄糖、果糖具有轉(zhuǎn)運(yùn)能力,并且對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力高于果糖,且PbrSTP11沒(méi)有轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖和山梨醇的活性,說(shuō)明PbrSTP11具有轉(zhuǎn)運(yùn)糖的特異性。為了進(jìn)一步探究梨PbrSTP11調(diào)控花粉生長(zhǎng)發(fā)育的功能,通過(guò)as-ODN技術(shù)抑制PbrSTP11基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)梨花粉管的生長(zhǎng)減慢,可能是由于花粉生長(zhǎng)過(guò)程中“庫(kù)”端糖類卸載受阻,同時(shí)蔗糖水解產(chǎn)生的果糖和葡萄糖在胞外大量積累,不能有效轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi),從而抑制了花粉管的生長(zhǎng)。在含高質(zhì)量濃度葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的花粉生長(zhǎng)受到抑制,進(jìn)一步證實(shí)了胞外葡萄糖抑制花粉管生長(zhǎng)的特性。因此,PbrSTP11是將花粉胞外的單糖及時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)的關(guān)鍵蛋白,對(duì)梨花粉的正常生長(zhǎng)起重要作用。結(jié)合本研究結(jié)果,下一步將主要探索PbrSTP11的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,包括糖信號(hào)、生物脅迫以及非生物脅迫等對(duì)PbrSTP11蛋白表達(dá)的調(diào)控,以期為糖分進(jìn)入梨花粉管的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和調(diào)控生長(zhǎng)的功能研究提供理論依據(jù)。