基于“腠理開闔”理論的黑膏藥對寒凝血瘀證膝骨關(guān)節(jié)炎模型家兔血管反應(yīng)性研究Δ

王佳婧，朱 婷，劉紫衡，王艷宏#，李永吉#

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床研究部，哈爾濱 150001)

黑膏藥為傳統(tǒng)的外用經(jīng)典劑型之一，《理瀹駢文》中述“膏主通治，統(tǒng)六經(jīng)”，兼有內(nèi)治和外治的功效，在促“腠理開闔”和“活血通絡(luò)”方面受到歷代醫(yī)家的廣泛推崇[1]?！半砝怼笔侨梭w皮膚、肌肉和臟腑的紋理，是一身氣血津液升降出入的通路[2-4]?！半砝黹_闔”是一個中醫(yī)特色理論，但國內(nèi)外鮮有研究。王紅[5]在《以金黃膏藥對配伍規(guī)律探究外用中藥透皮給藥系統(tǒng)的物質(zhì)基礎(chǔ)》的研究中首次提出“腠理”是外用中藥的透皮通道，并提出“腠理開闔學(xué)說”理論。《素問·陰陽離合論》記載：“是故三陽之離合也，太陽為開，陽明為闔，少陽為樞。”中醫(yī)一般以皮膚屬太陽，肌肉屬陽明，腠理屬少陽。明代醫(yī)家汪機注：“太陽居表，在于人身如門之關(guān)，使?fàn)I衛(wèi)流于外者固；陽明主里，在于人身如門之闔，使?fàn)I衛(wèi)守于內(nèi)者固；少陽居中，在于人身如門之樞，轉(zhuǎn)動由之，使?fàn)I衛(wèi)出入內(nèi)外也?！苯Y(jié)合《中醫(yī)大辭典·基礎(chǔ)理論分冊》所載內(nèi)容，本課題組推測，腠理形似多孔的厚壁，“孔隙”收縮受全身機能調(diào)控；其間充滿液體，是物質(zhì)代謝的場所，也可緩沖減震[6]；其中存在各種黏膜淋巴細(xì)胞，參與多種免疫調(diào)節(jié)，承擔(dān)“防御”作用的是組織液內(nèi)的免疫細(xì)胞；故腠理的厚薄與疏密可預(yù)測衛(wèi)氣強弱及抵御外邪能力。

“腠理開闔”不僅是中醫(yī)理論中關(guān)于患病和治療過程的共識，而且在現(xiàn)代研究中也可以用于表征中藥外用制劑的治療作用。鄭培新[7]整理的《中醫(yī)名家學(xué)術(shù)經(jīng)驗集》中記錄：“凡邪居腠理之間，須以辛開腠理，推邪外出?！眰鹘y(tǒng)的黑膏藥制劑，處方用藥性味多為辛溫、苦寒，重用“生、毒、烈、香”四類藥味，通過調(diào)控腠理開闔，以奏拔病外出之效[8-10]。然而，目前關(guān)于“腠理開闔”的研究仍停留在理論階段，未見能夠表征該理論的實驗方法。因此，本實驗基于“腠理開闔”理論，探討黑膏藥的作用機制，嘗試建立表征“腠理開闔”的實驗方法，以期為“腠理開闔”研究提供參考。

狗皮膏是傳統(tǒng)黑膏藥制劑之一，《中華人民共和國藥典：一部》(2020年版)[11]中記載其用于風(fēng)寒濕邪、氣血瘀滯所致的痹病，癥見四肢麻木、腰腿疼痛、筋脈拘攣等?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》曰：“氣血者，喜溫而惡寒，寒則泣而不行，溫則消而去之。”狗皮膏具有祛風(fēng)散寒、活血止痛的功效，也與其多用辛熱藥性的中藥有關(guān)。寒凝血瘀主要由于寒邪造成血行失常而停滯于脈道之內(nèi)。本研究依據(jù)該理論，以寒涼刺激與藥物誘導(dǎo)相結(jié)合的方法建立動物模型。由于寒凝血瘀證膝骨關(guān)節(jié)炎患者會出現(xiàn)膝周血管系統(tǒng)異常變化的病理現(xiàn)象，中醫(yī)寒凝血瘀證表征與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的血流動力相似，臨床表現(xiàn)為血液呈凝聚濃稠、血流不暢等。故本研究基于彩色多普勒超聲技術(shù)的血管影像學(xué)特征，并輔以血液流變學(xué)指標(biāo)，進(jìn)行血管反應(yīng)性研究，探討黑膏藥促“腠理開闔”的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

雄性實驗用新西蘭家兔(體重2.5～3.0 kg)，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號為SYXK(黑)2016-004。

1.2 儀器

MyLabTM30CV型彩色超聲儀(意大利百勝醫(yī)療公司)；LBY-N7500B型血流變分析儀(北京普利生公司)；ME155DU型半微量電子天平(德國Mettler Toledo集團(tuán))；THP79JU型紅外電子耳溫槍(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備公司)；YHW-2型紅外電子額溫槍(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備公司)；動物手術(shù)器械(泰州百諾醫(yī)療器械有限公司)。

1.3 藥品與試劑

木瓜蛋白酶P3250(Sigma-Aldrich中國公司)；狗皮膏1(廠家一，批號為20181004)；狗皮膏2(廠家二，批號為180304)；狗皮膏3(廠家三，批號為20181003)；黑膏藥基質(zhì)(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院)；脫毛膏(深圳市妮雅絲美容有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 寒凝血瘀證膝骨關(guān)節(jié)炎家兔模型的制備

構(gòu)建膝骨關(guān)節(jié)炎病證結(jié)合寒凝血瘀證家兔模型，將家兔隨機分空白組與造膜組。空白組家兔每日飼喂并記錄體重和體溫；造膜組家兔原創(chuàng)性地采用藥物誘導(dǎo)疊加寒涼刺激方法，制備家兔的寒凝血瘀證膝骨關(guān)節(jié)炎模型。模型制備分預(yù)試期與造模期，各7 d。預(yù)試期每日正常飼喂，記錄體重和體溫。造模期將造膜組家兔雙膝關(guān)節(jié)脫毛，采用75%乙醇消毒，并保證喂食量不變；配置濃度為5%木瓜蛋白酶的0.9%氯化鈉溶液，在第1、4和7日將家兔后肢屈曲45 °，以髕骨下極髕腱外緣為進(jìn)針點，向髁間窩方向進(jìn)針，抵達(dá)股骨髁后回撤2 mm，注入5%木瓜蛋白酶的0.9%氯化鈉溶液0.5 mL，雙側(cè)各1次。注射后輔助家兔進(jìn)行后肢膝關(guān)節(jié)做屈伸運動，使誘導(dǎo)劑可以充分?jǐn)U散。第1次注射后，每日將家兔的雙側(cè)后肢置于0～1 ℃冰水混合物中1次，每次30 min，反復(fù)冷凍7 d后復(fù)制出寒凝血瘀證膝骨關(guān)節(jié)炎家兔模型。

2.2 實驗動物分組及給藥

將造模成功的45只家兔隨機分為五組，即狗皮膏廠家一組、廠家二組和廠家三組，基質(zhì)組、模型組，每組9只。另取9只未造模家兔作為空白組，與模型組在室溫(25 ℃)條件下飼養(yǎng)，不做其他處理。廠家一組、廠家二組、廠家三組和基質(zhì)組家兔膝關(guān)節(jié)周圍脫毛，分別貼敷3 cm×3 cm狗皮膏1、2、3和黑膏藥基質(zhì)[黑膏藥基質(zhì)，即按照《中華人民共和國藥典：一部》(2020年版)[11]中狗皮膏制法制備的不含藥材的空白基質(zhì)]。取狗皮膏/黑膏藥基質(zhì)稱重并記錄為M1，將膏體加熱軟化，少量多次涂抹于家兔預(yù)留的靶部位上，覆以背襯層固定；將剩余的狗皮膏/黑膏藥基質(zhì)稱重并記錄為M2，M1與M2之差即為給藥質(zhì)量，約1.25 g。每貼膏藥貼敷60 h，間隔12 h繼續(xù)貼敷第2貼，連續(xù)15 d。

2.3 基于彩色多普勒超聲技術(shù)的膝周動脈網(wǎng)血管影像學(xué)特征研究

六組家兔分別于0、1、2、3、4、5、6、7和15 d采用MyLabTM30CV彩色超聲診斷系統(tǒng)掃查右側(cè)膝周動脈網(wǎng)(股動脈下段、膝上外側(cè)動脈和膝下外側(cè)動脈)，各部位血管管徑和流速結(jié)果見表1—6。

根據(jù)表1數(shù)據(jù)，對各組0～15 d的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗。0 d組間F檢驗P>0.05，說明各組在給藥0 d時股動脈下段管徑的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。15 d組間F檢驗P<0.05，說明各組在給藥15 d時的差異有統(tǒng)計學(xué)意義,采用Dunnett’s C基于Student極差配對進(jìn)行方差分析：(1)基質(zhì)組與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);(2)廠家一、二組與基質(zhì)組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);(3)廠家一組與廠家二組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 六組家兔股動脈下段血管管徑的測量結(jié)果Tab 1 Vascular diameter of lower femoral artery among six groups of rabbits mm)

根據(jù)表2數(shù)據(jù)，對各組0～15 d的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗。0 d組間F檢驗P>0.05，說明各組在給藥0 d時股動脈下段流速的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。15 d組間F檢驗P<0.05，說明各組在給藥15 d時的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，采用Dunnett’s C基于Student極差配對進(jìn)行方差分析：(1)廠家一組與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；(2)廠家一、三組與基質(zhì)組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；(3)廠家一組與廠家二組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 六組家兔股動脈下段流速的測量結(jié)果Tab 2 Flow velocity of lower femoral artery among six groups of rabbits mm/s)

根據(jù)表3數(shù)據(jù)，對各組0～15 d的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗。0 d組間F檢驗P>0.05，說明各組在給藥0 d時膝上外側(cè)動脈管徑的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。15 d組間F檢驗P<0.05，說明各組在給藥15 d時的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，采用Dunnett’s C基于Student極差配對進(jìn)行方差分析：(1)廠家一組、廠家二組、廠家三組、基質(zhì)組與模型組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； (2)廠家三組與廠家一組、基質(zhì)組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明在0.05的顯著性水平下，三廠家狗皮膏及黑膏藥基質(zhì)組在給藥15 d后，對膝上外側(cè)動脈管徑均能產(chǎn)生顯著的改善作用，但四組組間比較亦存在差異。

表3 六組家兔膝上外側(cè)動脈血管管徑的測量結(jié)果Tab 3 Vascular diameter of lateral superior genicular artery among six groups of rabbits mm)

根據(jù)表4數(shù)據(jù)，對各組0～15 d的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗。0 d時各組不滿足方差齊性， 采用Dunnett’s C基于Student極差配對進(jìn)行方差分析，顯示各組在給藥0 d時膝上外側(cè)動脈流速的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。15 d組間F檢驗P<0.05，說明各組在給藥15 d時差異有統(tǒng)計學(xué)意義，采用Dunnett’s C基于Student極差配對進(jìn)行方差分析：(1)廠家一組、廠家二組、廠家三組、基質(zhì)組與模型組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；(2)廠家二組與基質(zhì)組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；(3)廠家一組、廠家二組、廠家三組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明在0.05的顯著性水平下，三個廠家的狗皮膏及黑膏藥基質(zhì)在給藥15 d后，對膝上外側(cè)動脈流速均能產(chǎn)生顯著改善作用，但四組組間亦存在差異。

表4 六組家兔膝上外側(cè)動脈流速的測量結(jié)果Tab 4 Flow velocity of lateral superior genicular artery among six groups of rabbits mm/s)

根據(jù)表5數(shù)據(jù)，對各組0～15 d的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗。0 d組間F檢驗P>0.05，說明各組在給藥0 d時膝下外側(cè)動脈管徑的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。15 d組間F檢驗P<0.05，說明各組在給藥15 d時差異有統(tǒng)計學(xué)意義，采用Dunnett’s C基于Student極差配對進(jìn)行方差分析：(1)廠家一組、廠家二組、廠家三組、基質(zhì)組與模型組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； (2)其他組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表5 六組家兔膝下外側(cè)動脈血管管徑的測量結(jié)果Tab 5 Vascular diameter of inferior lateral genicular artery among six groups of rabbits mm)

根據(jù)表6數(shù)據(jù)，對各組0～15 d的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗。0 d時各組不滿足方差齊性，采用Dunnett’s C基于Student極差配對進(jìn)行方差分析，顯示各組在給藥0 d時膝下外側(cè)動脈流速的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。15 d組間F檢驗P<0.05，說明各組在給藥15 d時差異有統(tǒng)計學(xué)意義，采用Dunnett’s C基于Student極差配對進(jìn)行方差分析：(1)廠家一組、廠家二組、廠家三組、基質(zhì)組與模型組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);(2)廠家二組、廠家三組與基質(zhì)組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);(3)廠家一組、廠家二組、廠家三組組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表6 六組家兔膝下外側(cè)動脈流速的測量結(jié)果Tab 6 Flow velocity of inferior lateral genicular artery among six groups of rabbits mm/s)

2.4 基于血液流變學(xué)指標(biāo)變化特征的輔助研究

各組家兔分別于0、6和15 d采取耳緣靜脈，于LBY-N7500B錐板式血流變分析儀進(jìn)行全血黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和紅細(xì)胞變形指數(shù)檢測，見表7。對各組進(jìn)行統(tǒng)計分析，由全血黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和紅細(xì)胞變形指數(shù)3個血液流變學(xué)指標(biāo)數(shù)據(jù)可知：(1)隨給藥時間延長，廠家一組、廠家二組、廠家三組和基質(zhì)組各指標(biāo)水平均表現(xiàn)出與0 d時的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；(2)與模型組相比，廠家一組、廠家二組、廠家三組給藥6、15 d時上述指標(biāo)水平的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，給藥6 d時基質(zhì)組的紅細(xì)胞聚集指數(shù)與模型組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；(3)與基質(zhì)組相比，廠家二組給藥6 d時的全血黏度，廠家一組和廠家三組給藥15 d時的紅細(xì)胞聚集指數(shù)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；(4)與廠家一組相比，廠家二組、廠家三組給藥6 d時的3個血液流變學(xué)指標(biāo)，廠家三組給藥15 d時的全血黏度和紅細(xì)胞變形指數(shù)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由以上結(jié)果可知，貼敷狗皮膏后可顯著改善模型家兔血液黏滯度。

表7 六組家兔血液流變學(xué)指標(biāo)變化特征Tab 7 Characteristics of hemorheological indicators of six groups of rabbits

3 討論

目前，對于寒凝血瘀證膝骨關(guān)節(jié)炎的研究大多為臨床觀察，如藥物[12]、手法推拿或兩者聯(lián)合[13]等治療情況，雖得到了有效結(jié)論，但均缺少作用機制的研究。本研究從狗皮膏施治特點入手，制備寒凝血瘀證膝骨關(guān)節(jié)炎模型，考察狗皮膏治療作用制劑，同時探究黑膏藥劑型是否起到一定作用。實驗動物選擇與人體膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)較為接近的新西蘭家兔，模型制備方法采用寒涼刺激與藥物誘導(dǎo)結(jié)合技術(shù)[14]。關(guān)節(jié)內(nèi)應(yīng)力分布不均致軟骨損傷是臨床上膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制[15]。而注射木瓜蛋白酶與人體膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程略有不同，其通過降低軟骨Ⅱ型膠原蛋白含量，致使關(guān)節(jié)軟骨損傷和退變，進(jìn)而發(fā)展成為膝骨關(guān)節(jié)炎的病理狀態(tài)[16]。采用注射誘導(dǎo)劑的方法造模成功率高，制備周期短，避免了膝關(guān)節(jié)因手術(shù)或制動造模帶來的外傷，局部皮膚完整未破損，因此更適用于后期外治法的研究[17]。

寒凝血瘀證的臨床表現(xiàn)為血液呈凝聚濃稠，血流不暢。本研究選擇股動脈下段、膝上外側(cè)動脈和膝下外側(cè)動脈作為靶血管，觀察其管徑和血流速情況；收集家兔造模前后血樣，觀察其血液流變學(xué)指標(biāo)情況。課題組前期工作已證實，空白組飼養(yǎng)7 d后與模型組造模7 d后的家兔膝關(guān)節(jié)股動脈下段、膝上外側(cè)動脈和膝下外側(cè)動脈的管徑和血流速發(fā)生顯著性變化，造模后管徑明顯變窄、血流速明顯降低。同時，血樣的血液流變學(xué)指標(biāo)也表現(xiàn)出顯著性差異，造模后全血黏度和紅細(xì)胞聚集指數(shù)明顯升高，紅細(xì)胞變形指數(shù)明顯降低。因此，可以用上述指標(biāo)評估寒凝血瘀證膝骨關(guān)節(jié)炎模型家兔“腠理開闔”的變化規(guī)律。

有關(guān)“腠理開闔”作用的表征，目前多從“腠理”“衛(wèi)氣”和“營氣”三方面著手，其中又以“營氣”的表征最為常見，表征“營氣”可從評價皮下血循環(huán)的角度開展?！靶皽‰怼保颊叨嘁娊?jīng)脈不利、血脈不通，增進(jìn)血循環(huán)能使肢體損傷迅速消除。臨床上多借助彩色多普勒超聲檢查目標(biāo)血管的參數(shù)變化，并輔助血液流變學(xué)指標(biāo)診斷血循環(huán)情況。此外，中藥復(fù)方發(fā)揮療效的載體是劑型[18]。因此，本研究依據(jù)上述方法嘗試表征黑膏藥促“腠理開闔”作用，同時為了探究劑型作用，設(shè)立了基質(zhì)組。根據(jù)研究結(jié)果可知，15 d治療周期后，廠家一組、廠家二組、廠家三組和基質(zhì)組家兔3處靶血管的管徑均有增加，血流速均有提高。在家兔股動脈下段部位，與模型組相比，基質(zhì)組的管徑有顯著增加，廠家一組的血流速有顯著提高，其他組指標(biāo)有提高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在家兔膝上外側(cè)動脈部位，與模型組相比，廠家一組、廠家二組、廠家三組和基質(zhì)組的管徑均顯著增加，除廠家二組外，其他三組的血流速均顯著提高；在家兔膝下外側(cè)動脈部位，與模型組相比，廠家一組、廠家二組、廠家三組和基質(zhì)組的管徑和血流速均顯著提高。廠家一組、廠家二組、廠家三組和基質(zhì)組家兔的血液流變學(xué)指標(biāo)中，全血黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均呈現(xiàn)降低趨勢，紅細(xì)胞變形指數(shù)呈現(xiàn)升高趨勢。并且，與模型組相比，廠家一組、廠家二組、廠家三組和基質(zhì)組家兔全血黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和紅細(xì)胞變形指數(shù)的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

“腠理開闔”理論已提出多年，但關(guān)于如何表征“腠理開闔”還沒有明確的研究成果，仍在不斷探索之中。相比解剖學(xué)上的組織器官，中醫(yī)更加注重的是各部分間整體協(xié)調(diào)的關(guān)系[19]。因此，欲用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)證實中醫(yī)的理論，則要求既尊重中醫(yī)規(guī)律，又符合科學(xué)規(guī)范。本研究通過對黑膏藥血管反應(yīng)性研究，探討其促“腠理開闔”的作用機制，試圖探索“腠理開闔”的表征方法，為今后該類研究提供指導(dǎo)和方向。

綜上所述，貼敷狗皮膏可致目標(biāo)血管參數(shù)發(fā)生顯著變化，且黑膏藥基質(zhì)也具有誘發(fā)膝周動脈網(wǎng)血管效應(yīng)的作用，提示黑膏藥劑型在促進(jìn)“腠理開闔”方面，基質(zhì)同樣起到了關(guān)鍵作用。