NaCl脅迫下殼聚糖影響菜用大豆結(jié)瘤固氮的研究

孟 飛，宋明月，孫繼鑫，代重陽(yáng)，王振軍，王 聰

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028043；2.內(nèi)蒙古伊品生物科技有限公司，內(nèi)蒙古 赤峰 024076；3.興安盟農(nóng)牧技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古 烏蘭浩特 137400）

豆科植物和根瘤菌的共生系統(tǒng)可以把空氣中的氮元素固定成氨元素，固定氮素的同時(shí)還能為寄主植物提供大量氮肥［1］。在豆科植物的生長(zhǎng)過(guò)程中，根瘤的共生固氮為其提供重要的氮源，對(duì)于提高豆科植物的質(zhì)量和產(chǎn)量起著十分重要的作用［2］。同時(shí)，它不僅可以減少因?yàn)榛瘜W(xué)氮肥的大量使用對(duì)土壤結(jié)構(gòu)造成的破壞和水污染，而且可以改善土壤，增加土壤肥力，有利于可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展。然而，豆科植物的生物固氮效率受逆境因素的影響，尤其環(huán)境脅迫，不僅對(duì)于豆科植物根瘤的形成、發(fā)育有很大的影響，同時(shí)還影響根瘤的固氮效率［3］。周嬋嬋等［4］研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫對(duì)水稻的產(chǎn)量、品質(zhì)及其農(nóng)藝性狀均有十分嚴(yán)重的影響。張威等［5］研究表明，鹽脅迫可顯著抑制大豆的根瘤數(shù)，鹽脅迫對(duì)于菜用大豆的結(jié)瘤和固氮均有嚴(yán)重影響。而且大豆根瘤在形成初期對(duì)鹽脅迫十分敏感。喻定文等［6］研究結(jié)果表明，在NaCl處理下，植株催化大氣中氮轉(zhuǎn)變成氨的固氮酶活性下降，致使酶活性受到顯著抑制。

殼聚糖（CTS）是甲殼素脫乙?；蟮玫降木郯被咸烟?。它是一種非常廉價(jià)和清潔的化學(xué)物質(zhì)，對(duì)植物抗逆能力的增強(qiáng)有顯著的促進(jìn)作用。劉桂智［7］研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖對(duì)日光溫室內(nèi)黃瓜的株高、鮮重等指標(biāo)有顯著增強(qiáng)作用；而盛瑋等［8］則發(fā)現(xiàn)，殼聚糖能顯著緩解NaCl脅迫下小麥種子的萌發(fā)和小麥幼苗的生長(zhǎng)，徐芬芬等［9］研究結(jié)果表明，100 mg·L-1的CTS作為誘抗劑，可明顯改善鹽脅迫下小白菜的多種生理指標(biāo)，提高小白菜的抗氧化能力，并且提高膜穩(wěn)定性進(jìn)而減輕鹽害。宋士清等［10］研究發(fā)現(xiàn)，外源殼聚糖能有效減輕黃瓜幼苗的受傷害程度，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育。目前，殼聚糖對(duì)鹽脅迫下豆科植物結(jié)瘤固氮作用的研究報(bào)道較少。

土壤鹽堿化是目前全球關(guān)注的最重要的問(wèn)題之一。我國(guó)的鹽漬化情況比較嚴(yán)重。到目前為止，中國(guó)現(xiàn)有的鹽堿土地總面積已超過(guò)9 000萬(wàn)hm2。而土壤又因受到很多因素的影響，致使土壤鹽漬化和次生鹽漬化不斷加?。?1-12］，這種環(huán)境條件嚴(yán)重威脅著農(nóng)作物的生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境建設(shè)，不利于植物的可持續(xù)發(fā)展。目前，大多數(shù)廣泛種植的作物品種均對(duì)NaCl脅迫敏感甚至高度敏感，植株耐鹽性普遍較低［13］。在目前的植物生產(chǎn)過(guò)程中，十分迫切地需要一種清潔、廉價(jià)并且環(huán)?？尚械姆椒▉?lái)維持NaCl脅迫下豆科植物與根瘤菌之間良好的共生關(guān)系，同時(shí)維持好這種良好的共生關(guān)系對(duì)于豆科植物提高耐鹽性也有一定的幫助。本研究以不同鹽敏感度的菜用大豆為試材，研究外源殼聚糖對(duì)于NaCl脅迫下的菜用大豆結(jié)瘤和固氮的影響，目的在于為緩解豆科植物的鹽分障礙提供新的理論與方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菜用大豆品種選用不同鹽敏感度的品種，分別為鹽敏感品種“日本青”與耐鹽品種“綠領(lǐng)八號(hào)”?！叭毡厩唷苯臃N與其共生匹配性較好的快生型根瘤菌HH103，“綠領(lǐng)八號(hào)”接種與其共生匹配性較好的慢生根瘤菌USDA122［14］（均購(gòu)買(mǎi)于黑龍江省農(nóng)科院微生物研究所）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試材培育 挑選生長(zhǎng)狀況一致的種子，在95%乙醇沖洗30 s后，再用次氯溶液消毒，撈出后用無(wú)菌水沖洗2遍，隨后播入上口徑25 cm、下口徑10 cm、高15 cm、底部有小孔的硬質(zhì)塑料缽中。每缽播2粒種子，定苗1株。放入人工氣候箱中培養(yǎng)，晝夜溫度保持在18～25℃。

1.2.2 試驗(yàn)處理 設(shè)5個(gè)殼聚糖（CTS）濃度處理：100、150、200、250、300 mg·L-1，以蒸餾水作為空白對(duì)照1（CK1），50 mmol·L-1的NaCl溶液（預(yù)備試驗(yàn)篩選，在此濃度下，菜用大豆能夠生長(zhǎng)，同時(shí)能夠形成根瘤）脅迫作為對(duì)照2（CK2）。待菜用大豆幼苗的2片真葉完全展開(kāi)后，在大豆幼苗的葉片上均勻噴灑殼聚糖無(wú)菌水溶液，以量足但不下滴為宜，對(duì)照噴灑無(wú)菌水。于殼聚糖誘導(dǎo)處理的5 d后，將溶有NaCl的無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液均勻地澆入基質(zhì)中，CK1僅澆無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液。每處理12株，3次重復(fù)，各植株完全隨機(jī)排列。

1.2.3 菌懸液制備 將活化后的根瘤菌接種到培養(yǎng)基中，然后于黑暗中振蕩培養(yǎng)得到菌懸液。菌懸液制備后通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定其吸光值來(lái)確定根瘤菌的活菌數(shù)。

1.2.4 接種 NaCl處理后隨即當(dāng)天接種。將根瘤菌懸浮液稀釋并測(cè)定其吸光值至OD600值0.1，每株大豆秧苗的根部噴注搖勻的菌懸液1 mL后，每棵植株根部覆蓋同樣厚度的蛭石。放入人工氣候箱中培養(yǎng)。包括蛭石在內(nèi)的所有實(shí)驗(yàn)用具在使用前均進(jìn)行20 min的高壓滅菌。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

在接種30 d后，從塑料缽中完整地取出菜豆植株，不破壞其根系。于清水中緩慢反復(fù)沖洗蛭石且不損害根瘤，取根瘤時(shí)數(shù)根瘤數(shù)并測(cè)根瘤鮮重，取完根瘤后立即測(cè)定根瘤固氮酶活性，根瘤豆血紅蛋白含量、根瘤類(lèi)菌體NH3含量、根瘤細(xì)胞漿NH3含量及根系活力，最后將植株烘干，測(cè)定各處理的植株干重和植株地上、地下部的含氮量。

采用劉文鈺等［15］的乙炔還原法對(duì)根瘤的固氮酶活性進(jìn)行測(cè)定；參考WANG等［16］的方法對(duì)根瘤豆血紅蛋白含量進(jìn)行測(cè)定；參考李慧等［17］的方法對(duì)根瘤的類(lèi)菌體NH3含量和細(xì)胞漿NH3含量進(jìn)行測(cè)定；參考凱氏定氮法［18］測(cè)定植株地上、地下部的含氮量；根系活力的測(cè)定參考朱秀云等［19］的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS、Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆植株生長(zhǎng)的影響

NaCl脅迫下（CK2）2個(gè)品種菜用大豆的地上部、地下部生物量較對(duì)照（CK1）均顯著下降，降幅分別為28%、44%和25%、42%。而CTS處理后，對(duì)2個(gè)品種地上部、地下部生物量均產(chǎn)生了不同程度的影響，其中，“日本青”地上部、地下部生物量在150、200、250 mg·L-1濃度下較CK2均顯著升高，增幅分別為10%、21%、10%和35%、48%、32%，其余濃度下未見(jiàn)顯著影響；“綠領(lǐng)八號(hào)”地上部、地下部生物量在100、150、200、250 mg·L-1濃度下均較CK2顯著升高，增幅分別為12%、12%、24%、9%和27%、36%、55%、30%，此外，其地下部生物量在300 mg·L-1處理下較CK2也顯著升高24%（表1）。上述結(jié)果顯示，一定濃度CTS處理能顯著緩解菜用大豆的鹽脅迫傷害，且200 mg·L-1的CTS表現(xiàn)出較強(qiáng)的緩解效應(yīng)；而相對(duì)于地上部，CTS對(duì)地下部的緩解作用較強(qiáng)。與“日本青”相比，200 mg·L-1CTS對(duì)“綠領(lǐng)八號(hào)”地上部、地下部生物量均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的緩解效應(yīng)，說(shuō)明適宜CTS濃度下，耐鹽品種具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)潛力。

表1 NaCl脅迫下殼聚糖對(duì)菜用大豆生物量的影響Tab.1 Effects of chitosan on biomass of vegetable soybean under NaCl stress

2.2 殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆結(jié)瘤固氮的影響

2個(gè)品種菜用大豆的根瘤數(shù)，根瘤鮮重，地上部、地下部植株含氮量在NaCl脅迫下（CK2）受到了顯著抑制，而CTS處理后對(duì)2個(gè)品種各指標(biāo)均產(chǎn)生了不同程度的促進(jìn)作用，其中，“日本青”根瘤數(shù)和根瘤鮮重在150、200、250 mg·L-1濃度下較CK2均顯著升高，增幅分別為31%、39%、34%和18%、46%、21%；100 mg·L-1CTS處理下地下部植株含氮量較CK2顯著升高9%，150、200、250 mg·L-1CTS下地上部、地下部植株含氮量均較CK2顯著升高，其增幅分別為8%、14%、9%和17%、29%、12%?！熬G領(lǐng)八號(hào)”在100 mg·L-1CTS處理下其根瘤鮮重較CK2顯著升高16%，在150、200、250、300 mg·L-1下其根瘤數(shù)、根瘤鮮重較CK2均顯著升高，增幅分別為33%、57%、41%、24%和16%、50%、22%、19%；地上部、地下部植株含氮量在100、150、200 mg·L-1CTS濃度下較CK2的增幅分別為7%、9%、15%和12%、13%、30%，此外，地上部植株含氮量在250 mg·L-1CTS處理下較CK2顯著升高8%（表2）。上述結(jié)果表明，一定濃度CTS處理能顯著緩解鹽脅迫對(duì)菜用大豆結(jié)瘤固氮的阻遏作用，且200 mg·L-1CTS濃度表現(xiàn)出較強(qiáng)的緩解效應(yīng)。與“日本青”相比，200 mg·L-1CTS對(duì)“綠領(lǐng)八號(hào)”的結(jié)瘤固氮具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。

表2 殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆的結(jié)瘤固氮的影響Tab.2 Effects of chitosan on nodulation and nitrogen fixation of vegetable soybean under NaCl stress

2.3 殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆根瘤豆血紅蛋白含量和固氮酶活性的影響

NaCl脅迫下（CK2）導(dǎo)致2個(gè)品種菜用大豆的根瘤豆血紅蛋白含量和固氮酶活性大幅下降，降幅分別達(dá)34%、37%和33%、34%，而CTS處理后對(duì)2個(gè)品種根瘤豆血紅蛋白含量和固氮酶活性均產(chǎn)生了不同程度的誘導(dǎo)作用，其中，“日本青”根瘤豆血紅蛋白含量和固氮酶活性在150、200、250、300 mg·L-1CTS濃度下均較CK2顯著升高，增幅分別為19%、33%、17%、23%和23%、35%、23%、20%；“綠領(lǐng)八號(hào)”在150、200、250 mg·L-1CTS濃度下的增幅分別達(dá)25%、33%、25%和24%、37%、26%（表3）。表明NaCl脅迫下一定濃度外源CTS能顯著促進(jìn)菜用大豆根瘤中血紅蛋白的合成并且提高固氮酶活性，且200 mg·L-1CTS的作用較強(qiáng)。與“日本青”相比，200 mg·L-1CTS對(duì)“綠領(lǐng)八號(hào)”根瘤豆血紅蛋白含量和固氮酶活性有較強(qiáng)的誘導(dǎo)作用。

表3 NaCl脅迫下殼聚糖對(duì)菜用大豆的根瘤豆血紅蛋白含量和固氮酶活性的影響Tab.3 Effects of chitosan on hemoglobin content and nitrogenase activity in rhizobium of vegetable soybean under NaCl stress

續(xù)表3

2.4 殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆根系活力的影響

NaCl脅迫（CK2）對(duì)2個(gè)品種菜用大豆的根系活力產(chǎn)生了顯著的抑制作用，而CTS處理使其根系活力均有不同程度的回升，其中，“日本青”在100、150、200 mg·L-1濃度下較CK2的增幅分別為13%、16%、32%；“綠領(lǐng)八號(hào)”在150、200、250 mg·L-1濃度下較CK2的增幅分別為17%、32%、18%（圖1）。表明外源CTS能緩解鹽脅迫對(duì)菜用大豆根系造成的傷害，且200 mg·L-1的CTS具有較強(qiáng)的緩解效應(yīng)。

圖1 NaCl脅迫下殼聚糖對(duì)菜用大豆根系活力的影響Fig.1 Effects of chitosan on root activity of vegetable soybean under NaCl stress

2.5 殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆細(xì)胞中的氨含量（細(xì)胞漿）和類(lèi)菌體的影響

NaCl脅迫下（CK2）對(duì)2個(gè)品種菜用大豆的根瘤類(lèi)菌體產(chǎn)生了顯著的抑制作用，而CTS處理使其根瘤類(lèi)菌體有了不同程度的回升，其中，“日本青”在150、200、250、300 mg·L-1濃度下較CK2的增幅分別為22%、27%、18%、21%；“綠領(lǐng)八號(hào)”在200、250、300 mg·L-1濃度下較CK2的增幅分別為14%、8%、9%。NaCl脅迫下（CK2）使2個(gè)品種菜用大豆的根瘤細(xì)胞漿顯著升高，而CTS處理使其根瘤細(xì)胞漿有了不同程度的降低，其中，“日本青”在200、250、300 mg·L-1濃度下較CK2的降幅分別為8%、7%、6%；“綠領(lǐng)八號(hào)”在150、200、250、300 mg·L-1濃度下較CK2的降幅分別為7%、9%、8%、9%（表4）。表明外源CTS能在鹽脅迫下對(duì)菜用大豆根瘤中N2的還原及NH3的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化產(chǎn)生顯著的緩解效果。

表4 殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆根瘤類(lèi)菌體和細(xì)胞漿中氨含量的影響Tab.4 Effects of chitosan on ammonia content in rhizobia and cytoplasm of vegetable soybean under NaCl stress

續(xù)表4

3 討論

試驗(yàn)表明，鹽脅迫對(duì)于豆科植物的根瘤形成、發(fā)育以及植物地上、地下部的固氮效率均有顯著的抑制作用。王聰?shù)龋?0］研究表明，鹽脅迫不僅顯著抑制豆科植物-根瘤菌的共生體系，而且抑制根瘤菌的生長(zhǎng)，大幅度降低根瘤菌的抗氧化能力，最終導(dǎo)致豆科植物的幼苗早期生長(zhǎng)受抑制。在本試驗(yàn)中，2個(gè)菜用大豆品種的根瘤數(shù)量和鮮重在NaCl脅迫下顯著下降，并顯著降低了根系活力，抑制了植株的生長(zhǎng)。殼聚糖處理后，鹽脅迫下菜用大豆的結(jié)瘤數(shù)、根瘤鮮重、根系活力及植株生物量顯著升高，說(shuō)明殼聚糖（CTS）可以減輕NaCl脅迫對(duì)菜用大豆根系造成的傷害，并且通過(guò)改善菜用大豆根系的生長(zhǎng)狀況的方式，來(lái)改善地上部分植株的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)狀況。同時(shí)，殼聚糖可以減輕NaCl對(duì)根瘤菌造成的傷害，這可能是殼聚糖誘導(dǎo)鹽脅迫下菜用大豆結(jié)瘤的重要原因之一。

現(xiàn)有研究表明，豆血紅蛋白可以將O2轉(zhuǎn)移到類(lèi)菌體的鐵血紅蛋白中，從而有效地維持豆科植物根瘤內(nèi)較低的O2，并且豆血紅蛋白含量的高低反映了固氮酶活性的大?。?1］，且另有DAKORA等［22］研究表明了植物的根瘤固氮酶活性隨著豆血紅蛋白含量的增加而增加。在本研究中，外源殼聚糖處理對(duì)于NaCl脅迫下的菜用大豆根瘤中豆血紅蛋白含量與固氮酶活性均有顯著的緩解抑制作用，說(shuō)明外源殼聚糖處理具有提高根瘤中的豆血紅蛋白含量的作用，從而滿足大豆根瘤對(duì)于高流量、低氧環(huán)境的需求，進(jìn)而提高菜用大豆的固氮酶活性，促使鹽脅迫下的固氮作用能有效進(jìn)行；外源殼聚糖顯著提高了鹽脅迫導(dǎo)致的菜用大豆根瘤豆血紅蛋白含量的降低，從而提高根瘤固氮酶活性，進(jìn)而升高根瘤類(lèi)菌體中氨含量；同時(shí)，殼聚糖處理后顯著降低了鹽脅迫下2個(gè)品種菜用大豆根瘤細(xì)胞漿中NH3濃度，表明外源殼聚糖處理能促進(jìn)NH3進(jìn)一步向下轉(zhuǎn)化，而NH3被轉(zhuǎn)化的同時(shí)也促進(jìn)了根瘤中固氮酶活性含量的增加。在大量的固氮酶作用下，根瘤類(lèi)菌體中更多的N2還原為NH3，并迅速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿中，形成良性循環(huán)。NH3在GOGAT酶和GS酶的共同作用下轉(zhuǎn)化為氨基酸，當(dāng)根瘤細(xì)胞漿中NH3快速轉(zhuǎn)化為氨基酸并且合成蛋白質(zhì)時(shí)，才能促使固氮作用不斷進(jìn)行［23-24］。這可能是NaCl脅迫下CTS促進(jìn)菜用大豆固氮的重要原因之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的CTS處理能顯著促進(jìn)NaCl脅迫下菜用大豆的結(jié)瘤固氮作用，而200 mg·L-1CTS則表現(xiàn)出較強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，說(shuō)明200 mg·L-1是CTS促進(jìn)鹽脅迫下菜用大豆結(jié)瘤固氮的適宜濃度；與鹽敏感品種“日本青”相比，200 mg·L-1CTS對(duì)耐鹽品種“綠領(lǐng)八號(hào)”根瘤數(shù)、瘤重及根部固氮量均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的促進(jìn)作用，表明CTS對(duì)耐鹽品種“綠領(lǐng)八號(hào)”結(jié)瘤固氮具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)潛力。

4 結(jié)論

一定濃度的外源CTS能促進(jìn)NaCl脅迫下菜用大豆結(jié)瘤固氮。NaCl脅迫下，CTS通過(guò)提高根系活力，改善植株?duì)I養(yǎng)狀況，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)瘤；通過(guò)維持較高的根瘤固氮酶活性、加速NH3轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)固氮作用。200 mg·L-1CTS表現(xiàn)出較強(qiáng)的誘導(dǎo)作用。