中藥前胡在不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的5種香豆素類成分含量變化的高效液相色譜法測(cè)定

賈 彬，王 芳，宋向文，李肖莉，陳存武，3，，韓邦興，3

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230031；2.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；3.安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 六安 237012)

前胡首載于陶弘景的《名醫(yī)別錄》，作為中藥使用已有1800多年歷史。《別錄》曰∶前胡，二月、八月采根，曝干[1](P122)。前胡具有祛除痰熱、鎮(zhèn)定咳嗽和平喘降氣的作用[2-5]。傘形科植物白花前胡PeucedanumpraeruptorumDunn的干燥根為2020版《中華人民共和國國藥典》收錄前胡的唯一來源[6](P277)。白花前胡目前多生長于長江流域以南，在安徽、江西、四川以及浙江等地都有分布[7-10]。

前胡野生資源由于過度采挖，數(shù)量越來越少，已難以滿足市場(chǎng)需求，因此開展了野生改家種的工作[11]，現(xiàn)在市場(chǎng)上流通的前胡藥材多為家種。但是大量的調(diào)研結(jié)果表明：市場(chǎng)上的前胡藥材質(zhì)量存在嚴(yán)重不合格的現(xiàn)象，國家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局在《2020年中藥材質(zhì)量不合格年度報(bào)告》中公示：“2020年度中藥材不合格前10名中，位于榜首的前胡已三年連續(xù)上榜，其檢測(cè)不合格項(xiàng)主要集中于含量測(cè)定項(xiàng)，如白花前胡甲素等”。究其原因很可能是由于各生產(chǎn)環(huán)節(jié)對(duì)前胡中藥材質(zhì)量問題關(guān)注不夠、把關(guān)不嚴(yán)，如在前胡干燥過程中操作不規(guī)范的問題[12]，《中國藥典》規(guī)定前胡應(yīng)曬干或低溫干燥，邱曉霞研究發(fā)現(xiàn)[13]，50 ℃干燥時(shí)白花前胡甲素和乙素的比例發(fā)生了明顯的改變，建議前胡的干燥溫度應(yīng)控制在50 ℃以下；再如由于前胡藥材與同科或同屬如濱海前胡、碎葉山芹、紫花前胡、蕨葉藁本、異葉茴芹、石防風(fēng)、短片藁本等植物的根部的形態(tài)特征比較相近，外形鑒別比較困難，因此市場(chǎng)上存在摻混偽品現(xiàn)象[14-16]，進(jìn)而加劇了前胡的質(zhì)量不合格問題。

為了系統(tǒng)研究中藥前胡不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的質(zhì)量變化規(guī)律，本研究選取鮮藥材、產(chǎn)地加工、和市場(chǎng)這三個(gè)重要的生產(chǎn)環(huán)節(jié)，運(yùn)用高效液相色譜法對(duì)前胡中5種香豆素類成分進(jìn)行含量檢測(cè)。探究了前胡在不同的生產(chǎn)環(huán)節(jié)中5種香豆素類成分含量及各成分相對(duì)比例的變化，為前胡藥材的生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鮮藥材5批：采自安徽省寧國市；產(chǎn)地加工5批：購自安徽省寧國市；市場(chǎng)銷售5批：樣品從安徽、河南、江西和湖北四個(gè)省份的藥材市場(chǎng)購買。經(jīng)韓邦興教授鑒定為傘形科植物白花前胡的根。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

高相液相色譜儀：日本島津(LC-2030C 3D PLUS CN)，色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18( 150 mm×4.6 mm，5 μm)，十萬分之一電子天平，德國賽多利斯公司。前胡香豆精I(xiàn)(上海源葉生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：B50414，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：95.0%，以下統(tǒng)一簡(jiǎn)稱為PI)、白花前胡甲素(中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.4%，以下統(tǒng)一簡(jiǎn)稱為PA)、前胡香豆精I(xiàn)I(上海源葉生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：B5041，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：97.8%，以下統(tǒng)一簡(jiǎn)稱為PII)、白花前胡乙素(中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.9%，以下統(tǒng)一簡(jiǎn)稱為PB)和白花前胡E素(上海源葉生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：B20036，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.9%，以下統(tǒng)一簡(jiǎn)稱為PE)。甲醇(色譜純，上海麥克林生化科技公司)；水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方法參照《中國藥典》中的含量測(cè)定項(xiàng)中規(guī)定的方法，并略作改動(dòng)，具體實(shí)驗(yàn)方法如下[17]。

2.1 預(yù)處理

將前胡樣品干燥，粉碎，過三號(hào)篩，儲(chǔ)存待用。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

將對(duì)照品配制成PI濃度為30.592 μg/mL、PA為79.94 μg/mL、PII為29.824 μg/mL、PB為86.88 μg/mL和PE為58.688 μg/mL的甲醇混合溶液。

2.3 供試品溶液的制備

用電子天平稱取前胡粉末約0.5 g，將其置于100 mL的錐形瓶中，加入25 mL 100%氯仿溶液，密畢瓶塞，稱量，超聲波(功率為250 W，頻率為33 kHz)提取10分鐘，放置冷卻至室溫，再稱重，用100%氯仿補(bǔ)足失重，將混合液搖勻，過濾；用移液槍精密抽取續(xù)濾液10 mL置于蒸發(fā)皿中，于55 ℃下水浴蒸干，蒸去續(xù)濾液中的氯仿，將剩余殘留物用無水甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，即得。

2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，并對(duì)不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)進(jìn)行多成分配對(duì)檢驗(yàn)等處理，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相∶甲醇-水(75∶25)；流速為1.0 mL/min-1；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長 235 nm；進(jìn)樣量10 μL。5種香豆素類成分對(duì)照品和前胡樣品的色譜圖，見圖1。

A. 對(duì)照品；B. 供試品；1.PI；2.PA；3PII；4.PB；5.PE。圖1 5種對(duì)照品和前胡樣品的HPLC圖

3.1.2 線性關(guān)系考察

將2.2中配制的對(duì)照品溶液用甲醇溶液等比例混勻稀釋8份。按照3.1.1中色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，運(yùn)用軟件分析得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(其中橫坐標(biāo)為進(jìn)樣濃度，縱坐標(biāo)為峰面積)和回歸方程，結(jié)果表明PI、PA、PII、PB和PE在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系(R2=0.9999)。

3.1.3 精密度考察

將2.2中配制的對(duì)照品溶液按照3.1.1中的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，分別得到PI、PA、PII、PB和PE峰面積的RSD值分別為0.3%、0.26%、0.27%、0.26%和0.25%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

3.1.4 重復(fù)性考察

取6份同一批次的前胡粉末約0.5 g，按上述“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，并按照3.1.1中的色譜條件測(cè)定并計(jì)算每份樣品的含量，計(jì)算含量的RSD。PI、PA、PII、PB和PE含量的RSD分別為3.62%、0.92%、2.68%、2.49%和1.43%，表明重復(fù)性良好。

3.1.5 穩(wěn)定性考察

取同一份前胡供試品溶液，分別于室溫下0 h，2 h，4 h，8 h，16 h，24 h按照3.1.1中的色譜條件進(jìn)行測(cè)量，記錄峰面積，計(jì)算5種香豆素成分PI、PA、PII、PB和PE峰面積的RSD分別為0.97%、0.18%、0.18%、0.06%和0.26%，結(jié)果表明供試品提取液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.6 加樣回收率考察

取已知含量的前胡粉末約0.50 g(其中PI含量為0.49 mg/g、PA含量為6.04 mg/g、PII含量為0.46 mg/g、PB含量為3.43 mg/g和PE含量為2.09 mg/g)，共6份，分別加入一定量以上5種香豆素成分的混合液，按照上述“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，并按照3.1.1中的色譜條件測(cè)定每份樣品的峰面積，分別計(jì)算各組分的回收率為97.56%、98.19%、101.17%、98.80%和96.41%。這表明該試驗(yàn)方法準(zhǔn)確度良好。

3.2 樣品測(cè)定結(jié)果

鮮藥材、產(chǎn)地加工和市場(chǎng)銷售的5種香豆素類成分含量檢測(cè)結(jié)果見表1。《中國藥典》規(guī)定中藥前胡中的PA含量不得低于0.90%，PB含量不得低于0.24%。根據(jù)表2中的結(jié)果得出，三個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)的15組樣品中僅鮮藥材環(huán)節(jié)中的樣品1和2符合藥典要求。鮮藥材環(huán)節(jié)的前胡樣品PA和PB合格率分別為40%、60%；產(chǎn)地加工環(huán)節(jié)的前胡樣品兩種成分合格率分別為60%、40%；市場(chǎng)銷售環(huán)節(jié)的兩種成分合格率分別為0%、40%，結(jié)果表明市場(chǎng)上前胡藥材檢測(cè)不合格項(xiàng)主要集中于含量測(cè)定項(xiàng)的PA，該結(jié)論與《2020年中藥材質(zhì)量不合格年度報(bào)告》中公示的結(jié)果一致。

表1 樣品含量測(cè)定結(jié)果

利用SPSS軟件對(duì)其進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果見表2。從鮮藥材到產(chǎn)地加工環(huán)節(jié)，前胡藥材中的PI的平均含量由0.046±0.003%下降至0.019±0.009%(p<0.01)；市場(chǎng)上的前胡藥材中PA含量由0.538±0.147%到0.804±0.178%，顯著低于鮮藥材環(huán)節(jié)(p<0.05)，由0.538±0.147%到0.948±0.142%，極顯著低于產(chǎn)地加工環(huán)節(jié)(p<0.01)。將每個(gè)前胡樣品中的5種香豆素類成分含量之和定義為總含量，則通過表3可以得出，從鮮藥材環(huán)節(jié)(總含量為1.544±0.381%)到產(chǎn)地加工環(huán)節(jié)(總含量為1.501±0.128%)，再到市場(chǎng)銷售環(huán)節(jié)(總含量為1.019±0.201%)，前胡中的5種香豆素類成分總含量呈降低趨勢(shì)，且產(chǎn)地加工和市場(chǎng)這兩環(huán)節(jié)的5種香豆素類成分總含量呈差異顯著(p<0.05)。

表2 不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)的前胡中香豆素類成分平均含量(x±s)

各前胡樣品分別以不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)含量相近的PII的平均含量為 1，則上述5種成分之間的含量比例關(guān)系如圖2所示?？梢缘贸?，在不同的生產(chǎn)環(huán)節(jié)中，各成分之間的相對(duì)比例關(guān)系發(fā)生了較為明顯的變化。市場(chǎng)銷售環(huán)節(jié)的前胡中的PA相對(duì)比例(9.3∶1)低于田間栽培(16.1∶1)和產(chǎn)地加工環(huán)節(jié)(16.9∶1)；從田間種植到產(chǎn)地加工，再到市場(chǎng)，PB和PE的相對(duì)比例在逐漸降低。

圖2 不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)的前胡中香豆素類成分相對(duì)比例圖

4 討論與結(jié)論

4.1 不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)中前胡藥材質(zhì)量的影響因素討論

新鮮藥材的產(chǎn)地加工是中藥飲片生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)。本研究表明，前胡藥材在產(chǎn)地加工過程中產(chǎn)生了香豆素類成分的損耗，如PI含量由0.046±0.003%降至0.019±0.009%。因此，探究更加規(guī)范化和精細(xì)化的產(chǎn)地加工技術(shù)可以提高中藥飲片的質(zhì)量。

本研究結(jié)果與《2020年中藥材質(zhì)量不合格年度報(bào)告》中公示的結(jié)果一致表明：市場(chǎng)上前胡藥材的白花前胡甲素含量較低。前胡藥材從產(chǎn)地加工環(huán)節(jié)至市場(chǎng)銷售環(huán)節(jié)要經(jīng)歷運(yùn)輸、儲(chǔ)存等過程，目前有研究表明，光照會(huì)對(duì)前胡中香豆素類成分的含量產(chǎn)生影響，因?yàn)槠湓趶?qiáng)光條件下不穩(wěn)定[18]，因此前胡藥材儲(chǔ)存環(huán)境應(yīng)選在避光、陰涼的地方。另外前胡藥材的儲(chǔ)存時(shí)間和包裝材料等因素都會(huì)對(duì)藥材質(zhì)量產(chǎn)生影響[19]。

因此本課題組擬進(jìn)一步更為系統(tǒng)地探究中藥前胡在不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)中質(zhì)量變化的影響因素，如在鮮藥材環(huán)節(jié)考察種植模式對(duì)前胡質(zhì)量的影響；在產(chǎn)地加工環(huán)節(jié)探究不同干燥工藝對(duì)前胡質(zhì)量的影響[20]；在市場(chǎng)環(huán)節(jié)檢測(cè)前胡的常見混偽品，并運(yùn)用近紅外光譜技術(shù)建立一個(gè)鑒定前胡真?zhèn)蝺?yōu)劣的方法[21-23]，實(shí)現(xiàn)對(duì)前胡藥材的快速無損的鑒別。

4.2 創(chuàng)新點(diǎn)與結(jié)論

本研究從前胡藥材的生產(chǎn)環(huán)節(jié)入手，研究角度較為新穎，實(shí)驗(yàn)中以高效液相色譜法分析了中藥前胡在不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的5種香豆素類成分的變化。研究結(jié)果表明：所有前胡樣品均含PI、PA、PII、PB和PE這5種成分，但前胡在不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)中這5種成分的含量和相對(duì)比例產(chǎn)生了變化。本研究可為前胡藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)并對(duì)其他藥材的研究具有指導(dǎo)意義。