霍山石斛多酚組分提取工藝優(yōu)化與抗氧化活性研究

鄧 輝，劉莉彬，劉慶慧， 黃 征，祝啟張，寧克壯，韓邦興

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 六安 237012)

《神農(nóng)本草經(jīng)》中關(guān)于石斛的記載是石斛最早出現(xiàn)的地方[1]，距今有2300多年的歷史，而最開始有“石斛出六安”這個(gè)說法的是出自西漢的《范子計(jì)然》[2]?；羯绞?Dendrobiumhuoshanense)多藏身于崇山峻嶺的懸崖峭壁上，有補(bǔ)五臟虛勞的說法，享有極高的美譽(yù)[3]。近現(xiàn)代藥理研究表明，霍山石斛具有增強(qiáng)和調(diào)節(jié)免疫力、預(yù)防和治療白內(nèi)障、抗氧化、抗腫瘤等多種功效[4]。但是目前對(duì)霍山石斛的研究還是以多糖和生物堿等為主，而對(duì)其多酚的提取和抗氧化活性的研究還并沒有出現(xiàn)太多的報(bào)道。前人研究表明，植物多酚具有良好的應(yīng)用價(jià)值尤其是在抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等方面[5]。這些結(jié)果的出現(xiàn)充分說明了人們對(duì)總多酚組分研究和應(yīng)用的重視。

多酚的提取方法包含溶劑萃取、超聲波提取、微波提取法和超臨界流體提取等方法[6]。由于被提取的組分分子的極性和理化性質(zhì)存在差異，溶劑法提取動(dòng)植物體內(nèi)的活性成分，用相似相溶的原理來選擇溶劑類型，并且利用該性質(zhì)來獲取動(dòng)植物體內(nèi)的活性成分。本次實(shí)驗(yàn)采用溶劑萃取法進(jìn)行提取霍山石斛莖干中的總多酚組分，同時(shí)研究它的抗氧化活性，為今后霍山石斛的開發(fā)與利用提供相應(yīng)的理論支持。

1 材料

1.1 儀器設(shè)備

表1 儀器設(shè)備

1.2 材料和試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料

選自皖西學(xué)院藥用植物園中三年生霍山石斛，品質(zhì)優(yōu)良。品種經(jīng)皖西學(xué)院陳乃富教授鑒定為霍山石斛。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

表2 材料和試劑

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品制備

將新鮮的霍山石斛莖段洗凈放于60 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干，研磨至粉碎狀，裝入袋中備用。

2.2 樣品中多酚含量的制備及其測(cè)定方法

精確稱取0.0250 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水定容，得到質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密量取0.5、1.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL沒食子酸，在容量瓶中定容成50 mL的標(biāo)準(zhǔn)系列貯備液，再分別吸取各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列貯備液1.0 mL于10 mL容量瓶中，分別加入0.3 mL FC(Folin-Ciocalteu’s phenol Reagent)試劑，充分混勻，加入1.5 mL 20%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容，充分混勻，在室溫下放置20 min[7]。用蒸餾水作為空白組，用1 cm比色皿測(cè)定在760 nm波長(zhǎng)的吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[8-9]，得到線性回歸方程y = 0.4933x+0.0579，R2= 0.9908，見圖1。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別取霍山石斛多酚提取液1.00 mL于10 mL的容量瓶中，加入0.3 mL FC試劑，充分搖勻，加入1.5 mL的20%碳酸鈉溶液，定容搖勻，在黑暗處放置20 min。將空白組用作試劑空白做對(duì)照，用1 cm比色皿測(cè)定波長(zhǎng)在760 nm處的吸光度，并根據(jù)回歸方程計(jì)算多酚得率。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

通過文獻(xiàn)的查閱，采用對(duì)溶劑類型、溶劑pH、料液比、溶劑乙醇濃度4個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，篩選對(duì)霍山石斛總多酚的提取有影響的因素[10-13]。

2.3.1 溶劑類型的選擇

精密稱取0.5 g霍山石斛，提取溶劑用50% 甲醇、乙醇和丙醇，料液比為1∶30，溶劑的pH為4，過濾得提取液，測(cè)量多酚的提取率，并選擇最佳提取溶劑。

2.3.2 溶劑濃度的選擇

精密稱取霍山石斛，乙醇濃度分別為50%～100%，料液比為1∶30，溶劑pH為4，過濾，得到粗提液，得出多酚的得率，并選擇最佳的溶劑乙醇濃度。

2.3.3 料液比的選擇

精密稱取霍山石斛，采用1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40的料液比，80%乙醇為提取溶劑，溶劑pH為4，過濾，得到粗提液，得出多酚的得率，并選擇最佳的料液比。

2.3.4 溶劑pH的選擇

用軟件分析單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出三要素三變量的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在該實(shí)驗(yàn)結(jié)果中選擇三個(gè)變量值分別標(biāo)記為A、B和C。

2.5 ABTS自由基清除活性實(shí)驗(yàn)

通過文獻(xiàn)上的方法，配制ABTS反應(yīng)液，暗反應(yīng)16 h，用pH值為7.4的磷酸緩沖液稀釋該反應(yīng)液，吸光度顯示在734 nm時(shí)值為0.70 ± 0.02結(jié)果較佳，分別配出濃度為0.02～0.12 mg/mL的VC液和反應(yīng)液備用[14-15]。取各濃度的VC液和樣品液0.1 mL，混合1 mL ABTS反應(yīng)液，靜置20 min后，在734 nm處測(cè)量A，空白組用蒸餾水替代，重復(fù)測(cè)量3次得到平均值，用公式計(jì)算清除率。

清除率=(A空白對(duì)照-A樣品)/ A空白對(duì)照×100%(A為吸光度)

2.6 DPPH自由基清除活性實(shí)驗(yàn)

查閱文獻(xiàn)，稱量11 mg DPPH，70% 的乙醇溶解稀釋至100 mL，放到冰箱中備用[16]。配置濃度梯度為0.05 mg/mL到0.20 mg/mL的VC溶液和反應(yīng)液，各取0.3 mL VC液、樣品液，混入0.9 mL DPPH，充分搖勻，暗反應(yīng)30 min，測(cè)量在517 nm的吸光度，用蒸餾水組代替樣品液作為空白對(duì)比，重復(fù)測(cè)定3次得到平均值，通過下式計(jì)算清除率。

清除率=(A空白對(duì)照-A樣品)/ A空白對(duì)照×100%(A為吸光度)

3 結(jié)果與分析

3.1 提取溶劑對(duì)霍山石斛多酚提取率的影響

對(duì)于從霍山石斛中提取多酚，選擇合適的提取溶劑將為該提取帶來極大的便利。本次實(shí)驗(yàn)的條件為：濃度為50%甲醇、50%乙醇、50%丙酮，料液比1∶30，溶劑pH值為4。過濾提取物得出多酚含量。如下圖2所示，乙醇的提取率均高于甲醇和丙酮。由此可知，本次試驗(yàn)采納乙醇作為霍山石斛多酚的提取溶劑。

圖2 溶劑類型對(duì)霍山石斛多酚的影響

3.2 溶劑乙醇濃度對(duì)霍山石斛多酚提取率的影響

提取溶劑的乙醇濃度梯度別為60%～100%，料液比選擇1∶30，溶劑pH值為4。通過圖3可以看出，霍山石斛多酚得率在乙醇濃度為80%之前都是呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，然而，在超過80%之后，多酚得率趨于下降。因此選擇濃度為80%乙醇作為提取霍山石斛多酚組分的最佳溶劑。并且在之后的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中采用70%、80%、90%這3個(gè)水平值進(jìn)行評(píng)估。

圖3 溶劑乙醇濃度對(duì)霍山石斛多酚的影響

3.3 料液比對(duì)霍山石斛多酚提取率的影響

分別采用料液比分別為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40作為本次實(shí)驗(yàn)變量因素，用80%乙醇作為溶劑，溶劑pH值為4進(jìn)行本次實(shí)驗(yàn)。通過圖4可以看出，霍山石斛多酚得率在料液比為1∶35之前，有一個(gè)上升的趨勢(shì)，但在此之后，多酚得率出現(xiàn)開始降低。因此選擇料液比1∶35作為從霍山石斛提取多酚組分的最佳比例。并且在之后的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中采用1∶30、1∶35、1∶40這3個(gè)水平值進(jìn)行評(píng)估。

圖4 料液比對(duì)霍山石斛多酚的影響

3.4 乙醇pH值對(duì)霍山石斛多酚提取率的影響

本次實(shí)驗(yàn)用溶劑pH值作為變量，在料液比為1∶35，80%乙醇，分別進(jìn)行pH 2、3、4、5、6的單因素實(shí)驗(yàn)。通過圖5可以看出，霍山石斛多酚得率在pH值為4之前都是呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，但是在這之后，多酚得率出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。因此選擇pH值為4作為提取霍山石斛多酚組分的最佳pH。并且在之后的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中采用3、4、5這三個(gè)水平值進(jìn)行評(píng)估。

圖5 溶劑pH對(duì)霍山石斛多酚的影響

3.5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

3.5.1 響應(yīng)面模型的建立及分析

由單因素試驗(yàn)結(jié)果，再用軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行隨機(jī)性的篩選進(jìn)行Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表3。由Design-Expert 8軟件進(jìn)行擬合判斷該模型，得多元線性回歸方程：

多酚得率= +3.24+0.060A+0.065B-0.072C+0.033AB+0.018AC+0.051BC-0.13A2-0.24B2-0.18C2

(A、B、C 分別代表乙醇濃度、料液比、溶劑pH)

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

表4 霍山石斛多酚提取率回歸方差系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)

通過表4可知，F(xiàn)值為237.36，通過P值的結(jié)果可以看出該模型極其顯著，以及A、B、C對(duì)霍山石斛多酚提取率的影響也有極高的顯著性。由F值可以判斷出，各因素的影響的大小為：pH>料液比>溶劑濃度。除此之外，失擬項(xiàng)檢驗(yàn)P值(0.7146)顯示不顯著，表明該模型充分?jǐn)M合并且受其他因素影響較小。此外，該模型的相關(guān)系數(shù)R2(0.9967)接近1，說明本次模型具有較高的可信度。

由圖6可知，實(shí)際值和預(yù)測(cè)值分布相互接近基本呈現(xiàn)為直線，也證實(shí)該模型有較好的相關(guān)性。

圖6 實(shí)際值與預(yù)測(cè)值

3.5.2 效應(yīng)面分析

利用Design Expert (Version8.0.6) 軟件，獲得相應(yīng)二次回歸方程的等高線與三維響應(yīng)面圖，如圖7所示。根據(jù)模型所做的響應(yīng)曲面及其相應(yīng)的等高線圖可以得出溶劑濃度、料液比以及溶劑pH這3個(gè)影響因素對(duì)霍山石斛多酚提取率的互相作用, 以及通過控制其中任意一個(gè)變量為零水平時(shí)確定另外兩個(gè)變量對(duì)霍山石斛多酚提取率的影響，從而確定每個(gè)自變量的最佳水平范圍。

從圖7(a)可以看出，當(dāng)因子沿A(溶劑濃度)、B(料液比)因子轉(zhuǎn)移到峰值時(shí)，因素方向的等高線密度比B因素方向的等高線更加密集，說明更高的溶劑濃度會(huì)讓霍山石斛多酚得率的波動(dòng)更大，對(duì)多酚得率的影響也更加明顯。

圖7 溶劑濃度與料液比(a)、溶劑濃度與pH(b)、料液比與pH(c)對(duì)多酚提取率影響的等高線與效應(yīng)面

從圖7(b)可以看出，當(dāng)沿著A(溶劑濃度)、C(溶劑pH)因子分別向峰值移動(dòng)時(shí)，C因子方向的等高線密度比B因素方向的等高線更加密集，說明pH值對(duì)霍山石斛多酚得率的貢獻(xiàn)更大。

從圖7(c)可以看出，當(dāng)沿著B(料液比)、C(溶劑pH)因素分別向峰值移動(dòng)時(shí)，B因素方向的等高線密度比C因素方向的等高線更加稀疏，說明pH值對(duì)霍山石斛多酚得率的貢獻(xiàn)更大。

3.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過上述實(shí)驗(yàn)，可以得出獲得最佳響應(yīng)值的優(yōu)化條件：乙醇濃度為82.5%、料液比為1∶33.74、乙醇pH為4.64。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出的霍山石斛多酚得率為3.026 g/mL，接近預(yù)測(cè)值，無顯著差異，表明從該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷贸龅慕Y(jié)論是可行且可靠的。為了大規(guī)模化生產(chǎn)更加方便，最佳響應(yīng)值優(yōu)化為乙醇濃度為82%、料液比為1∶34、乙醇pH值為5。

3.7 樣品對(duì)自由基的清除能力

3.7.1 樣品對(duì)ABTS自由基的清除能力

VC和樣品對(duì)ABTS自由基的清除率見圖8，從圖中可以看出，VC對(duì)自由基的清除能力較好，而粗提物的清除能力有依賴性。在低濃度時(shí)，霍山石斛多酚在清除自由基的能力和VC對(duì)自由基的清除能力存在較大的差距，然而隨著總多酚濃度的增加，霍山石斛多酚提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力逐漸接近VC對(duì)ABTS自由基的清除能力，清除能力高達(dá)90%，說明粗提物對(duì)ABTS自由基有清除能力。

圖8 不同濃度VC、總多酚對(duì)ABTS自由基清除能力

3.7.2 樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力

VC和樣品對(duì)DPPH自由基的清除率見圖9，從圖中可以看出，VC對(duì)自由基的清除能力較好。粗提物對(duì)自由基的清除能力較之VC更差。在低濃度時(shí)，霍山石斛的總多酚在清除ABTS自由基的能力和VC清除DPPH自由基的能力有差距，然而隨著總多酚濃度的增加，霍山石斛多酚提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力逐漸接近VC對(duì)DPPH自由基的清除能力，且清除率基本達(dá)到90%，表明霍山石斛多酚的提取物對(duì)DPPH自由基具有清除能力。

圖9 不同濃度VC、總多酚對(duì)DPPH自由基清除能力

4 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)先由單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果確定了溶劑類型、料液比、溶劑pH值、溶劑乙醇濃度四個(gè)單因素較好的選擇范圍，基于此設(shè)計(jì)響應(yīng)面法的實(shí)驗(yàn)方案，再在此實(shí)驗(yàn)方案下進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，得到霍山石斛多酚組分最佳提取條件，最后進(jìn)行最佳實(shí)驗(yàn)條件下的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溶劑類型、料液比、溶劑pH值、溶劑乙醇濃度這四個(gè)單因素對(duì)霍山石斛多酚提取率均有影響且相互作用明顯。根據(jù)建立的二次回歸模型，霍山石斛多酚提取的最佳工藝路線是乙醇濃度為82%、料液比為1∶34、乙醇pH值為5，在該實(shí)驗(yàn)條件下，霍山石斛多酚的得率為3.026mg/mL?？寡趸钚詫?shí)驗(yàn)也說明，霍山石斛多酚提取液對(duì)ABTS自由基和DPPH自由基有革除作用?；羯绞喾釉谶_(dá)到一定的濃度后其抗氧化能力與VC相接近，尤其是對(duì)自由基有清除作用，表明霍山石斛多酚粗提液有抗氧化能力。但本次實(shí)驗(yàn)多酚提取液并沒有進(jìn)行純化，所以有關(guān)結(jié)論還需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究考證。