7S大豆球蛋白α-亞基的原核表達及分離純化

高夢楠，袁艷秋，巨 倩，胡亞云，欒廣忠

(西北農林科技大學 食品科學與工程學院，糧油功能化加工陜西省高校工程研究中心，陜西楊凌 712100)

大豆蛋白主要由7S(35%)與11S(52%)大豆球蛋白構成[1]，其中，7S大豆球蛋白(β-伴大豆球蛋白，β-conglycinin)對大豆蛋白功能性質有很大影響[2]。β-伴大豆球蛋白是一種復合糖蛋白，分子質量為150～200ku，由α (≈67ku)，α′ (≈71ku)，β (≈50ku)通過非共價鍵以不同的組合形成三聚體[3-5]。目前分離純化7S大豆球蛋白3個亞基難度較大，且無法大量制備，制約了研究的深入[8-11]。植物蛋白課題組前期通過基因重組技術完成重組大豆7S球蛋白α′-亞基及α-亞基核心區(qū)的基因克隆、原核表達及分離純化[6-8]，得到足夠量的亞基(或片段)材料，有效解決了α′-亞基及α-亞基核心區(qū)試驗材料的制備問題。

本研究對β-伴大豆球蛋白的α-亞基進行基因克隆、表達及分離純化，以期為后續(xù)構建大豆蛋白水分散體系[13]提供α-亞基材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘齊黃34’大豆，2019年種植并收獲于山東省濟南市，山東省農業(yè)科學院提供；感受態(tài)細胞E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、質粒pET-28a(+)，西安熱默爾生物科技有限公司提供；質粒pGEM-T Easy，普洛麥格(北京)生物技術有限公司提供。

1.2 主要試劑與儀器

PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、QuickCutTMEcoRⅠ、QuickCutTMXhoⅠ、DL 5000 DNA Marker、Premixed Protein Maker (Broad)，寶生物工程(大連)有限公司，中國。異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，北京索萊寶有限公司，中國；氨芐西林鈉鹽(Amp)、硫酸卡納霉素(Kana)，北京拜爾迪生物技術有限公司，中國；其余試劑均為國產分析純。

JY-SCZ2+電泳儀，北京君意東方電泳設備有限公司，中國；JY92-IIDN 超聲波細胞粉碎機，新芝(浙江寧波)生物科技有限公司，中國；ClearFirst-2000型蛋白純化系統(tǒng)，閃譜(上海)生物科技有限公司，中國。

1.3 試驗方法

1.3.1 重組克隆載體、表達載體的構建 根據NCBI官網(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)α-亞基編碼的基因序列(參考序列號為NM_001249927.2)設計一對特異性引物。上游引物(5′-GCGGACGACGACGACAAGGTGGAGAA- AGAAGAAT-3′)引入保護堿基和腸激酶酶切位點(加粗部分)方便后期去除純化后的重組α-亞基蛋白N-端標簽;下游引物(5′- ATACCGCTCGAGTTCAGTAAAAAGCCCTCAA-3′)引入XhoⅠ酶切位點(加粗的6個堿基)。

參照李垚熹等[12]的方法獲得α-亞基的cDNA，利用Premix Taq酶擴增α-亞基，設置模板缺失對照。將理論值約為1 660 bp的PCR產物，利用T4-DNA連接酶與線性化的克隆載體pGEM-T Easy相連接，構建pGEM-T Easy-α，并導入感受態(tài)細胞E.coliDH 5α中[12]。pGEM-T Easy-α與pET-28a表達系統(tǒng)同時利用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切出相同的粘性末端[14]，通過T4-DNA連接酶連接構建pET-28a-α，并導入感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)中。構建結果分別經藍白斑篩選、菌落PCR篩選[7]、EcoRⅠ/XhoⅠ單雙酶切鑒定[15-16]，對插入的α-亞基區(qū)域外送測序鑒定，測序結果通過NCBI進行BLAST分析，以確保所構建的pGEM-TEasy-α、pET-28a-α序列無誤。命名測序正確的pET-28a-α陽性菌株為pET-28a-α-BL21。

1.3.2 重組蛋白α-亞基表達條件的篩選 將pET-28a-α-BL21增菌培養(yǎng)8 h后按φ=1%接種量接種至含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至不同菌液濃度(OD600值為0.2、0.4、0.6、0.8)，加入誘導劑IPTG(0.2 mmol/L)后采用不同誘導溫度(25 ℃、30 ℃、 37 ℃)，不同誘導表達時間(3 h、5 h、7 h、9 h、11 h)來篩選重組α-亞基蛋白的表達條件[17-18]。采用φ=10%分離膠和φ=5%濃縮膠進行SDS-PAGE檢測，利用Image J軟件進行條帶灰度定性分析，目的條帶灰度占全部條帶灰度的百分數，即為目的蛋白占全蛋白的表達百分數。數據采用DPS 7.05進行單因素方差分析(ANOVA)，結果以“平均數±標準差”表示。采用鄧肯檢驗確定在0.05水平上的顯著性差異。

1.3.3 重組蛋白的表達與提取 挑pET-28a-α-BL21單菌落轉接至500 mL LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50 μg/mL)，利用“1.3.2”篩選出的條件誘導培養(yǎng)轉化菌，同時設置不含α-亞基的pET-28a和不進行誘導表達的pET-28a-α(IPTG濃度為0 mmol/L)分別做對照[16]。轉化菌液以7 500 r/min冷凍離心20 min，去除上層培養(yǎng)基得到菌體沉淀。添加60 mL磷酸鹽緩沖液PBS(20 mmol/L磷酸鈉緩沖液，0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L PMSF，0.02% NaN3，pH=7.4)于菌體沉淀，漩渦震蕩得到菌懸液，重復離心至上清清澈[12]。60 mL菌懸液超聲參數為：總時間80 min、超聲4 s、間隔6 s、功率270 W、12～15 ℃。超聲破碎1次后將破碎菌體在4 ℃的環(huán)境中以8 500 r/min的轉速離心45 min，取其上清液為目的蛋白α-亞基的粗蛋白液，用SDS-PAGE檢測上清中表達的目的蛋白，其余在4 ℃環(huán)境中保存。

1.3.4 重組蛋白的分離純化 提取的50 mL重組蛋白粗蛋白液使用0.45 μm孔徑的水性濾膜過濾除雜。將5 mL的His Trap HP預裝柱[20]安裝于蛋白純化系統(tǒng)，使用超聲后的超純水沖洗預裝柱5～10個柱體積，接著使用超聲后的平衡磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L磷酸鈉緩沖液，0.5 mol/L NaCl， 1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L PMSF，0.02% NaN3，pH=7.4)平衡預裝柱5～10個柱體積，待基線保持平衡使用自動上樣泵完成上樣。用超聲后的平衡緩沖液(分別含有0 mmol/L、500 mmol/L咪唑)進行線性洗脫，確定目的蛋白出峰時平衡緩沖液咪唑濃度，收集流動相。用出峰咪唑濃度、500 mmol/L咪唑平衡緩沖液進行分步洗脫，收集不同階段的流動相進行SDS-PAGE電泳檢測鑒定。

2 結果與分析

2.1 重組克隆載體pGEM-T Easy-α的構建及鑒定

以所提取的大豆總RNA為模板，通過設計的上、下游引物RT-PCR擴增得到α-亞基基因 (1 660 bp)，結果如圖1-A所示，泳道1為引物結合位點之間的片段。

藍白斑篩選出5個白色重組克隆載體pGEM-T Easy-α的單克隆菌株進行菌落PCR，結果如圖1-B所示。泳道2、8、10得到的片段長度與α-亞基理論分子量(1 660 bp)相一致；泳道1、7、9得到的片段長度與通用引物PCR所得基因理論長度(2 000 bp)相符。因此，選用泳道1、2、7、8、9、10的3個菌株進行后續(xù)試驗[19]。

M. DNA marker;A. 目的基因的擴增;1. α-亞基基因擴增結果;2. 陰性對照；B.菌落PCR鑒定;1、3、5、7、9. 單克隆菌株使用M47/M48通用引物擴增;2、4、6、8、10. 單克隆菌株使用設計的上、下游引物擴增;11. 空白使用通用引物M47/M48進行擴增;12. 空白使用設計的上、下游引物進行擴增；C. 酶切鑒定pGEM-T Easy-α重組質粒;1～3 .重組質粒pGEM-T Easy-α分別經EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ酶單酶切、雙酶切；4. 重組質粒pGEM-T Easy-α

酶切法鑒定重組克隆載體pGEM-T Easy-α結果見圖1-C。泳道1為經EcoRⅠ單酶切形成兩個清晰條帶，是由于目的基因片段兩端均帶有EcoRⅠ酶切位點；泳道2為經XhoⅠ單酶切形成單一的條帶(5 000 bp左右)，與載體pGEM-T Easy(3 015 bp)和目的基因α-亞基(1 660 bp)成功相連后的理論值大小相符。泳道3為經EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切得到5 000 bp、3 000 bp與 1 700 bp左右的條帶，分別與目的基因與載體相連、載體、目的基因的理論值大小相符。

于NCBI進行BLAST比對分析，測序的 1 635個堿基序列與α-亞基編碼區(qū)的243-1874堿基100%一致，表明構建序列無突變、移碼，目的基因已正確插入到重組質粒pGEM-T Easy-α中。

2.2 重組表達載體pET-28a-α的構建及鑒定

圖2-A、圖2-B為隨機挑選的6個pET-28a-α-BL21進行菌落PCR篩選的結果，可以看到泳道6、10、14、19、22擴增所得產物條帶大小均在 1 500 ～2 000 bp，約為1 700 bp，與目的基因理論長度相符，考慮到條帶的清晰度、彌散程度和亮度，選用泳道6、19的樣品進行下一步試驗。

如圖2-C，泳道1中經EcoRⅠ單酶切得到 7 000 bp左右的條帶，與pET-28a(5 369 bp)、 α-亞基基因(1 660 bp)成功相連接后的理論值相符，大于7 000 bp的條帶應為未被酶切的pET-28a-α；泳道2中經XhoⅠ單酶切得到與線性pET-28a-α(7 029 bp)理論值相符的條帶；泳道3經雙酶切所得條帶分子量大小正確(1 660 bp、5 369 bp)。

A、B. 菌落PCR鑒定；M. DNA marker；1、5、9、13、17、21. 單克隆菌株使用通用引物T7/T7Ter進行擴增；2、6、10、14、19、22. 單克隆菌株使用設計的上、下游引物進行擴增；3、7、11、15、18、23. 單克隆菌株使用T7和設計的下游引物進行擴增；4、8、12、16、20、24. 單克隆菌株使用設計的上游引物和T7Ter進行擴增；25、26. 空白分別使用T7/T7Ter和設計的上、下游引物進行擴增；C. 酶切鑒定重組質粒pET-28a-α；M. DNA marker；1-3. 分別經EcoRⅠ、XhoⅠ酶單雙酶切使pET-28a-α線性化

于NCBI進行BLAST比對分析，測序的 1 666個堿基序列與α-亞基編碼區(qū)的243-1874堿基100%一致，表明構建序列無突變、移碼，α-亞基基因已正確插入到重組表達載體pET-28a-α。

2.3 重組蛋白表達條件的篩選

圖3泳道1～20表明重組α-亞基蛋白分子質量約70 ku，單獨攜帶pET-28a的陰性對照未檢測到目的蛋白帶(圖3泳道21)。利用Image J軟件對圖3條帶進行灰度分析，結果如表1，目的蛋白表達含量小于10%的未列出。圖3-E、圖3-F條帶淺、較為彌散，表明在25 ℃大腸桿菌全蛋白表達含量較少，雖然泳道17目的蛋白表達占比例較高，但其含量不理想；圖3-A、圖3-B條帶較深，表明37 ℃適宜大腸桿菌進行蛋白表達，但是重組α-亞基蛋白表達占比例較低。結合表1數據，篩選出高效表達靶蛋白條件為菌液濃度(OD600) 0.6，30 ℃誘導培養(yǎng)9 h。此條件下目的蛋白表達量占全菌蛋白的25.83%。

表1 重組α-亞基蛋白的表達量Table 1 Expression of recombinant α-subunit protein

2.4 重組α-亞基在大腸桿菌中的表達及分離純化

利用“2.3”篩選出的條件培養(yǎng)pET-28a-α-BL21，超聲波破碎大腸桿菌釋放出靶蛋白的結果如圖4所示。與兩個對照(圖4泳道3、4)相比較，泳道1、2中均出現分子質量在70 ku左右的目的蛋白條帶，由于上清液中含有具有較好溶解性的目的蛋白(未形成包涵體)[21-23]，因此泳道2樣品可以進行重組蛋白的分離純化。

M. 蛋白標marker；1～2. pET-28a-α誘導培養(yǎng)后的全菌液、上清液；3. pET-28a-α經破碎后的上清液；4. 表達載體pET-28a

用His結合樹脂對泳道2的樣品進行鎳親和層析純化。兩次泵入10 mL樣品進行線性洗脫結果如圖5，洗脫液體積分數為70%(350 mmol/L的咪唑平衡緩沖液)時出現洗脫峰。將上樣峰(F1)與洗脫峰(F2)使用超濾離心管濃縮后的溶液及濾液進行SDS-PAGE電泳檢測，結果如圖6-A，目的蛋白在洗脫峰F2中的含量較高(泳道4)，但由于存在雜帶，因此決定使用分步洗脫(選用350、500 mmol/L的咪唑平衡緩沖液)進一步純化目的蛋白。

F1. 蛋白純化上樣峰；F2. 蛋白純化洗脫峰

M.蛋白質marker；A. 線性洗脫結果；B.分步洗脫結果；A：1. 未純化的樣品；2. 蛋白純化F1峰；3～4. 蛋白純化F2峰濃縮濾液、濃縮液；B：1. 上樣回收液；2～4 純化后樣品(分別用0 mmol/L、500 mmol/L和350 mmol/L咪唑的平衡緩沖液洗脫)

分步洗脫峰的流動相經SDS-PAGE檢測鑒定所得結果如圖6-B。泳道1存在分子質量70 ku的重組α-亞基蛋白帶，因為部分目標蛋白未結合到Ni2+親和柱上，隨平衡緩沖液流出；泳道2未發(fā)現有目的蛋白條帶，表明重組蛋白通過His標簽和親和柱上的鎳離子相結合，留在柱材上，未被平衡緩沖液洗脫下來；泳道4經Image J軟件進行灰度分析，所得目標蛋白純度可達到70.0%左右。

3 結 論

成功構建重組表達載體pET-28a-α并導入E.coliBL21(DE3)中。篩選出高效表達重組7S大豆球蛋白α-亞基的條件為：菌液濃度(OD600) 0.6，誘導培養(yǎng)溫度30 ℃，時間9 h。此條件表達的目的蛋白達大腸桿菌全菌蛋白的25.83%。利用鎳親和層析柱，通過350 mmol/L的咪唑磷酸鹽緩沖液進行洗脫，最終獲得純度可達70.0%左右的目的蛋白。