滅菌豬肉漿中發(fā)酵菌株脂質(zhì)水解和氧化能力分析

王吉，張?chǎng)?，胡靜榮，于智慧，朱迎春

滅菌豬肉漿中發(fā)酵菌株脂質(zhì)水解和氧化能力分析

王吉，張?chǎng)危o榮，于智慧，朱迎春

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷 030800

【】篩選具有較強(qiáng)脂質(zhì)水解能力和抗氧化能力的發(fā)酵菌株，為研發(fā)新型發(fā)酵劑提供理論基礎(chǔ)。在無菌豬肉漿體系中分別接種木糖葡萄球菌（）YSZ11、YCC3，腐生葡萄球菌（）YCC2，巨球菌（）YZC2、YZC3，并設(shè)立不接種發(fā)酵菌株為對(duì)照組（CK），測(cè)定發(fā)酵4 d內(nèi)豬肉漿pH、過氧化值（peroxide value，POV）、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值、脂肪酶活力、脂質(zhì)組成和游離脂肪酸含量的變化。5株發(fā)酵菌株均可以降低豬肉漿體系的pH，POV和TBARS值分別為2.51—2.96 mmol·kg-1和0.21—0.24 mg/100 g，顯著低于CK組（＜0.05）。在5組接種發(fā)酵菌株的豬肉漿中檢測(cè)到了中性脂肪酶、酸性脂肪酶和磷脂酶3種酶活力，且后兩者活性較高。發(fā)酵4 d后，接種發(fā)酵菌株組的磷脂含量顯著降低（＜0.05），游離脂肪酸含量增加了21.1%—73.7%，其中飽和脂肪酸總量顯著降低，不飽和脂肪酸含量顯著增加，尤其是棕櫚油酸（C16:1）、油酸（C18:1）和亞油酸（C18:2）含量較高，并檢測(cè)到亞麻酸（C18:3）。本試驗(yàn)中的5株菌株均可抑制脂質(zhì)的氧化，同時(shí)可以分泌脂肪酶促進(jìn)脂質(zhì)的水解，增加游離脂肪酸特別是不飽和脂肪酸的含量。其中，腐生葡萄球菌YCC2和木糖葡萄球菌YCC3脂質(zhì)水解和抗氧化能力較好，對(duì)改善發(fā)酵肉制品的品質(zhì)具有更明顯的促進(jìn)作用。

滅菌豬肉漿；發(fā)酵菌株；脂肪酶活；脂質(zhì)氧化；脂質(zhì)降解

0 引言

【研究意義】脂質(zhì)是發(fā)酵肉制品的主要組成成分，其水解和氧化程度對(duì)發(fā)酵肉制品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味形成起著至關(guān)重要的作用[1]，產(chǎn)生的游離脂肪酸及適量、適度的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物賦予發(fā)酵肉制品特殊的風(fēng)味和品質(zhì)，但脂質(zhì)的過度氧化會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品酸敗、產(chǎn)生有害物質(zhì)，最終影響產(chǎn)品的色澤、風(fēng)味和安全性[2]。報(bào)道顯示微生物在脂質(zhì)水解和氧化過程中發(fā)揮著重要的作用[3]，因此，篩選出同時(shí)具備較強(qiáng)脂質(zhì)水解能力和抗氧化能力的菌株對(duì)于改善發(fā)酵肉制品的品質(zhì)具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】現(xiàn)有研究中，雖然有報(bào)道顯示原料肉中的內(nèi)源性脂肪酶有較高的活性，參與脂質(zhì)代謝，但是微生物在發(fā)酵過程中也通過分泌脂肪酶，參與發(fā)酵肉制品的脂質(zhì)水解過程[4]。Xiao等[5]研究發(fā)現(xiàn)微球菌能夠促進(jìn)風(fēng)干腸中脂質(zhì)的水解，生成游離脂肪酸；Navarro等[6]研究顯示西班牙干腌香腸中接種發(fā)酵劑后游離脂肪酸的含量高于不接種發(fā)酵劑組。也有研究報(bào)道表明發(fā)酵菌株的加入可以降低發(fā)酵肉制品脂質(zhì)氧化的程度，如Flores等[7]研究顯示酵母菌屬發(fā)酵劑可以抑制脂肪的氧化和酸敗，改善發(fā)酵香腸的風(fēng)味；Bozkurt等[8]研究發(fā)現(xiàn)接種發(fā)酵劑（乳酸片球菌，植物乳桿菌和肉葡萄球菌）組土耳其香腸TBAR值為8.17 mg?kg-1，低于不接種發(fā)酵劑組（8.41 mg?kg-1）。【本研究切入點(diǎn)】雖然微生物在脂質(zhì)水解、氧化方面的作用已經(jīng)得到證實(shí)，但這些結(jié)論都是通過比較接種或不接種發(fā)酵劑的香腸樣品的品質(zhì)差異獲得。發(fā)酵香腸體系是一個(gè)復(fù)雜的生化體系，內(nèi)源性和外源性微生物、內(nèi)源性脂肪酶均在此體系中發(fā)揮作用，因此，為了更好地評(píng)價(jià)微生物對(duì)發(fā)酵肉制品脂質(zhì)水解和氧化的影響，本試驗(yàn)建立了體外滅菌的豬肉漿體系，排除了原料肉中內(nèi)源性酶和其他微生物的干擾?！緮M解決的關(guān)鍵問題】試驗(yàn)將筆者實(shí)驗(yàn)室前期經(jīng)過分離、純化、鑒定并保存的2株木糖葡萄球菌、2株巨球菌和1株腐生葡萄球菌分別作為發(fā)酵菌株（試驗(yàn)組）在無菌豬肉漿體系中進(jìn)行發(fā)酵，以不接種發(fā)酵劑作為對(duì)照組，探究發(fā)酵菌株對(duì)脂質(zhì)氧化和水解的影響，篩選具有較強(qiáng)水解能力和抗氧化能力的菌株，為研發(fā)新型發(fā)酵劑和提升肉制品品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2021年在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院畜產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 主要材料

新鮮豬肉購(gòu)于太谷縣家家利超市，瘦肉：豬后腿，肥肉：豬背膘。選用11月齡晉汾白豬（公），屠宰后0—4℃下吊掛24 h進(jìn)行排酸，0—4℃條件下30 min內(nèi)運(yùn)回山西農(nóng)業(yè)大學(xué)畜產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室；木糖葡萄球菌（）YSZ11、YCC3，腐生葡萄球菌（）YCC2，巨球菌（）YZC2、YZC3，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院畜產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑

De Man, rogosa, and Sharpe（MRS）固體和液體培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂均購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司；4-甲基傘形酮油酸酯（4-methylumbellifery- oleate）、4-甲基傘形酮（4-methylumbelliferone）、曲拉通X-100（Triton X-100）、乙二醇-雙-（2氨基乙醚）四乙酸（EGTA）、三氟化硼甲醇溶液（BF3·MeOH）均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、硫代硫酸鈉、氟化鈉均為分析純購(gòu)于天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；異丙醇、無水乙醇、乙醚、石油醚、甲醇、冰乙酸、三氯甲烷、正己烷均為分析純購(gòu)于天津市天力化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白（BSA）購(gòu)于天津永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）為分析純，購(gòu)于天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；氨基固相萃取小柱購(gòu)于北京中檢維康技術(shù)有限公司。

1.3 主要設(shè)備

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械產(chǎn)），HPP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），F(xiàn)A25高剪切分散乳化儀（上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司），SW-CJ-2FD雙人單面超凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），5804R高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），N-EVAP-112氮吹儀（美國(guó)Organomation Associates公司），UV-1100分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司），F(xiàn)96s熒光分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司），LC-CQ-24F固相萃取儀（上海邦西儀器科技有限公司），ST2100 pH計(jì)（奧豪斯儀器有限公司），CP114電子天平（奧豪斯儀器有限公司），SHZ-D(III)循環(huán)水式多用真空泵（河南省予華儀器有限公司），ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 發(fā)酵菌株活化 將甘油管中的菌株接種到營(yíng)養(yǎng)上進(jìn)行劃線，37℃培養(yǎng)72 h后，挑取單菌落在營(yíng)養(yǎng)肉湯中進(jìn)行傳代培養(yǎng)兩次（37℃、48 h），用冷凍離心機(jī)離心（10 000×、4℃、15 min）得到菌體沉淀，用無菌生理鹽水洗滌兩次，并將菌液濃度調(diào)至7—9 log cfu?mL-1。

1.4.2 無菌豬肉漿體系的建立 豬肉（肥瘦質(zhì)量比2﹕8）與純凈水1﹕1比例混合勻漿，并加入3%的葡萄糖和3%氯化鈉混勻，將豬肉漿分為5組分別轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，121℃高壓滅菌15 min，待冷卻至室溫時(shí)，將豬肉漿振蕩均勻，分別接種YSZ11、YCC2、YCC3、YZC2、YZC3菌株，使肉中的微生物濃度達(dá)到7 log cfu?g-1（以肉重為基礎(chǔ)）。設(shè)立不接種菌株的對(duì)照組，放入32℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵。分別在發(fā)酵第0、1、2、3和4天取樣進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.4.3 脂肪酶活力測(cè)定

1.4.3.1 酶液提取 參照Vestergaard[9]的方法，并稍作修改。稱取5.00 g發(fā)酵樣品，混勻后加入25 mL濃度為0.05 mol?L-1、pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液（含0.005 mol?L-1的EGTA），然后置于冰水浴中勻速攪拌30 min，之后用冷凍離心機(jī)（4℃、10 000×）離心20 min，濾去脂肪，得到用于分析酶活性的清液。

1.4.3.2 酶活力測(cè)定 參照Huang等[10]的方法測(cè)定酶活力。酸性脂肪酶活力測(cè)定所用緩沖液：pH 5.0的0.1 mol?L-1磷酸氫二鈉/0.05 mol?L-1檸檬酸緩沖液，其中含有0.8 mg?mL-1BSA和0.05% Triton X-100；中性脂肪酶活力測(cè)定所用緩沖液：pH 7.5的Tris/HCl緩沖液，其中含有0.05%的Triton X-100；磷脂酶活性測(cè)定所用緩沖液：pH 5.0的0.1 mol?L-1磷酸氫二鈉/0.05 mol?L-1檸檬酸緩沖液，其中含有0.8 mg?mL-1BSA和0.05% Triton X-100、0.15 mol?L-1氟化鈉。3種酶活力測(cè)定的反應(yīng)體系：2.8 mL緩沖液中加入0.1 mL酶液和0.1 mL 1 mmol?L-14-甲基傘形酮油酸酯，空白用加入同體積提取酶所用的緩沖液代替酶液。在37℃條件下反應(yīng)30 min后，酸性脂肪酶和磷脂酶用0.5 mL濃度為1 mol?L-1的鹽酸終止反應(yīng)，中性脂肪酶于冰水浴中進(jìn)行終止。中性脂肪酶用熒光分光光度計(jì)測(cè)定λex=328 nm、λex=443 nm處的熒光值，酸性脂肪酶和磷脂酶測(cè)λex=328 nm、λex=470 nm處的熒光值。用以上3種緩沖液配制梯度濃度的4-甲基傘形酮溶液，測(cè)熒光值得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出酶活力。一個(gè)酶活力單位表示1 g樣品在1 h內(nèi)生成1 nmol的4-甲基傘形酮。

1.4.4 脂質(zhì)組成

1.4.4.1 脂質(zhì)提取 參照Folch等[11]的方法，并稍作修改。精確稱取2 g樣品于含有20 mL氯仿﹕甲醇溶液（2﹕1）的50 mL離心管中，旋渦30 s，靜提15 min后于5 000×條件下離心10 min，過濾，在濾液中加入5 mL 0.85%氯化鈉溶液進(jìn)行分層，在3 000×條件下離心10 min，收集氯仿層并用氮吹儀吹干。

1.4.4.2 脂質(zhì)分離 參照Kaluzny等[12]的方法并稍作修改。用氨基固相萃取小柱對(duì)所提脂質(zhì)進(jìn)行吸附，將磷脂、中性脂質(zhì)、游離脂肪酸從總脂中分離出來。取5 mL氯仿溶液將柱子活化，將100 mg所提脂質(zhì)溶于1 mL氯仿溶液裝入柱子中進(jìn)行洗脫。用3 mL氯仿﹕異丙醇（2﹕1，w/w），3 mL 25%（w/w）乙酸/乙醚和3 mL甲醇分別洗脫中性脂質(zhì)、游離脂肪酸和磷脂。收集洗脫液并用氮?dú)獯蹈桑梅Q重法定量樣品中中性脂質(zhì)、游離脂肪酸和磷脂的含量。

1.4.5 脂肪酸分析 脂質(zhì)甲酯化：取15 mg游離脂肪酸，加入3 mL 0.5 mol?L-1的NaOH-CH3OH溶液進(jìn)行皂化（60℃水浴30 min），冷卻至室溫時(shí)后加入2 mL BF3·MeOH（14%）溶液，在60℃水浴中酯化20 min，待冷卻至室溫時(shí)加入2 mL 0.88% NaCl溶液和2 mL正己烷進(jìn)行分層，收集上層有機(jī)相并用氮?dú)獯蹈桑儆谜和槎ㄈ葜? mL進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）分析。

GC-MS分析：進(jìn)樣量為1 μL，進(jìn)樣口溫度為250℃，分流比為10﹕1，接口溫度為250℃。色譜升溫程序：10℃?min-1升至160℃維持3 min，10℃?min-1升至200℃維持2 min，再以2℃?min-1升至250℃維持10 min，載氣為氦氣，1.0 mL?min-1的流速。質(zhì)譜條件：離子源溫度230℃，電離方式為EI，電子能量為70 ev，質(zhì)譜掃描范圍為35—450 m/z。根據(jù)色譜圖對(duì)游離脂肪酸進(jìn)行定性定量分析。

1.4.6 pH測(cè)定 稱取30 g樣品，12 000 r/min均質(zhì)1 min后用pH計(jì)測(cè)定。

1.4.7 POV的測(cè)定 按照GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測(cè)定》，稱取2—3 g所提取的油脂樣品，置于250 mL碘瓶中，加30 mL三氯甲烷-冰乙酸（2﹕3）混合溶液。待樣品溶解后，再加入1 mL飽和碘化鉀溶液，并緊密塞好瓶塞，輕輕振搖0.5 min，然后置于暗處3 min，取出后加100 mL水，置于暗處3 min，取出后加100 mL水，搖勻，立即用硫代硫酸鈉作為標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡黃色。

式中，2：樣品所用硫代硫酸鈉溶液的體積（mL）；1：空白所用硫代硫酸鈉溶液的體積（mL）；c：硫代硫酸鈉溶液的濃度（mol?L-1）；m：樣品質(zhì)量（g）。

1.4.8 TBARS值的測(cè)定 精確稱取5 g肉樣研細(xì)，加50 mL 7.5%的三氯乙酸（含0.1%EDTA），振搖30 min，雙層濾紙過濾兩次，取5 mL上清液，加入5 mL 0.02 mol?L-12-硫代巴比妥酸溶液，沸水浴中保溫40 min，取出冷卻1 h后，以2 000×離心5 min，上清液加5 mL氯仿?lián)u勻，靜置分層后取上清液分別在532和600 nm處比色，記錄吸光度。

式中，m：樣品質(zhì)量（g）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Microsoft Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、相關(guān)性分析，＜0.05表示差異顯著，用SIMCA 14.1進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），用Hiplot（https://hiplot.com.cn/）繪制脂肪酸組成熱圖和脂質(zhì)氧化、水解的相關(guān)性熱圖，其余圖利用軟件Origin 8.0繪制。

2 結(jié)果

2.1 不同菌株發(fā)酵過程中pH的變化

由圖1可知，6組豬肉漿初始pH為5.71。在整個(gè)發(fā)酵過程中，CK組pH無顯著變化（＞0.05），5個(gè)試驗(yàn)組pH均呈下降趨勢(shì)，其中試驗(yàn)組YCC3和YZC3下降速率高于其他3個(gè)試驗(yàn)組，在發(fā)酵第3天時(shí)，pH分別為4.00和4.06。在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，YSZ11、YCC2、YCC3、YZC2、YZC3組pH分別為5.16、5.12、4.05、4.97、3.95，顯著低于CK組（＜0.05）。

不同大寫字母表示同一菌株不同發(fā)酵時(shí)間差異顯著（P＜0.05）；不同小寫字母表示不同菌株同一發(fā)酵時(shí)間差異顯著（P＜0.05）。下同

2.2 不同菌株對(duì)豬肉漿脂質(zhì)組成的影響

中性脂質(zhì)、磷脂、游離脂肪酸是原料肉中脂質(zhì)的主要組成成分，中性脂質(zhì)的含量最高，達(dá)到80.3 g/100 g；其次是磷脂和游離脂肪酸，分別為16.1和3.6 g/100 g（表1）。這一結(jié)果與Gandemer[13]的研究結(jié)果相差較大，可能因?yàn)樵先獾膩碓床煌?。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，CK組脂質(zhì)組成與發(fā)酵初始時(shí)無顯著變化，試驗(yàn)組中中性脂質(zhì)含量無顯著變化（＞0.05），而磷脂的含量由發(fā)酵開始時(shí)的16.1 g/100 g顯著下降（＜0.05），且顯著低于CK組（＜0.05）；游離脂肪酸含量顯著增加，與CK組相比，試驗(yàn)組游離脂肪酸含量增加了21.1%—73.7%。

2.3 不同菌株發(fā)酵過程中豬肉漿中脂肪酶活力的變化

由圖2可知，CK組在整個(gè)發(fā)酵過程中的3種脂肪酶均未檢測(cè)出活力，是因?yàn)樨i肉漿經(jīng)過高壓滅菌處理后，豬肉漿中內(nèi)源性脂肪酶失活。試驗(yàn)組中均檢測(cè)出脂肪酶活力，且3種脂肪酶活力均為先上升后下降的趨勢(shì)，在發(fā)酵第2—3天時(shí)酶活力達(dá)到最高。雖然在5組發(fā)酵體系中均檢測(cè)到中性脂肪酶、酸性脂肪酶和磷脂酶活力，但其活力明顯不同：酸性脂肪酶活力最高，活力在1.570—3.434 U?g-1，其次是磷脂酶活力，其水平最高達(dá)到1.784 U?g-1（YCC2組），而中性脂肪酶活力最弱，僅維持在0.207—0.348 U?g-1。

YSZ1、YCC3、YZC2、YZC3組的中性脂肪酶活力在發(fā)酵第1—2天時(shí)迅速上升，并在第2天時(shí)達(dá)到最高值，在后續(xù)發(fā)酵過程中酶活力下降，在發(fā)酵終點(diǎn)（第4 d）時(shí)，活性分別降低到0.003—0.135 U?g-1；YCC2組在發(fā)酵第3天時(shí)中性脂肪酶活達(dá)到最高（0.306 U?g-1），在發(fā)酵結(jié)束時(shí)活性下降為0.237 U?g-1，但仍顯著高于其他組（圖2-A）。YSZ11、YCC2、YCC3、YZC2組在發(fā)酵第2天的酸性脂肪酶活力最高，維持在1.762—3.434 U?g-1，在后續(xù)發(fā)酵過程中出現(xiàn)不同程度的下降；YZC3組在發(fā)酵第3天時(shí)，酸性脂肪酶活力最高為1.570 U?g-1，在之后的發(fā)酵過程中下降（圖2-B）。YSZ11、YCC3、YZC2組磷脂酶活性在發(fā)酵第2 天時(shí)活力最高，分別為1.397、1.654和1.344 U?g-1，并在后續(xù)發(fā)酵過程中下降；YCC2、YZC3組中磷脂酶活性在第3天時(shí)達(dá)到最高（圖2-C）。綜上可知，3種脂肪酶中，酸性脂肪酶和磷脂酶活性在脂質(zhì)水解中發(fā)揮主要作用，且菌株YCC2和YCC3這兩種脂肪酶活性高，更具有促進(jìn)脂質(zhì)水解的潛力。

表1 豬肉漿發(fā)酵過程中脂質(zhì)組成的變化

不同大寫字母表示同組發(fā)酵初始與結(jié)束時(shí)存在顯著差異（＜0.05）；不同小寫字母表示發(fā)酵結(jié)束時(shí)各組間存在顯著差異（＜0.05）

Different capital letters indicate significant differences between different fermentation time (＜0.05); Different lowercase letters indicate significant difference of different groups at the end of fermentation (＜0.05)

圖2 豬肉漿發(fā)酵過程中脂肪酶活力的變化

2.4 不同菌株對(duì)豬肉漿游離脂肪酸的影響

由表2可知，在所有樣品中共檢測(cè)出20種脂肪酸，肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸為各組豬肉漿中主要的脂肪酸。在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，CK組飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）總含量為48.28 mg/100 mg，顯著高于試驗(yàn)組（＜0.05），主要組成為肉豆蔻酸（C14:0）、棕櫚酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）。由圖3可知，CK組游離脂肪酸的組成和含量與試驗(yàn)組存在差異。通過聚類分析可知，YCC2和YCC3組游離脂肪酸組成及含量相似。

表2 豬肉漿發(fā)酵結(jié)束時(shí)游離脂肪酸的組成

“-”表示未檢出；不同小寫字母表示不同處理差異間顯著（＜0.05）

“-” indicate not be detected; Different lowercase letters indicate significant difference between different treatment (＜0.05)

圖3 發(fā)酵豬肉漿中游離脂肪酸熱圖

發(fā)酵終點(diǎn)，試驗(yàn)組中SFA的總含量43.80—45.71 mg/100 mg，比CK組低2.77—4.68 mg/100 mg，特別是YZC2組中C14:0的含量為2.96 mg/100 mg，YCC3組中C16:0含量為22.32 mg/100 mg，YCC2中C18:0的含量為15.77 mg/100 mg，都顯著低于CK組（＜0.05）。至發(fā)酵結(jié)束，試驗(yàn)組中不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）的含量達(dá)到54.29—56.19 mg/100 mg，顯著高于CK組（51.50 mg/100 mg）（＜0.05），說明接種微生物會(huì)促進(jìn)UFA的釋放。各組豬肉漿中單不飽和脂肪（monounsaturated fatty acid，MUFA）中油酸（C18:1）的含量最高，棕櫚油酸（C16:1）次之。5組試驗(yàn)組中C18:1的含量及2組試驗(yàn)組（YCC2、YCC3）C16:1的含量均顯著高于CK組（＜0.05）。各組豬肉漿中多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）主要組成是亞油酸（C18:2）。在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，試驗(yàn)組中PUFA含量顯著高于CK組（＜0.05），尤其是C18:2的含量，另外在試驗(yàn)組YCC3、YZC3中檢測(cè)出亞麻酸（C18:3）。此外，試驗(yàn)組UFA/SFA值顯著高于CK組（＜0.05）。因此，本試驗(yàn)的5種菌株在發(fā)酵過程中可以促進(jìn)MUFA和PUFA的釋放。

2.5 不同菌株發(fā)酵過程中豬肉漿POV的變化

由圖4可知，發(fā)酵當(dāng)天，豬肉漿POV為1.87 mmol?kg-1。在整個(gè)發(fā)酵過程中，5組發(fā)酵豬肉漿POV均呈上升趨勢(shì)。在發(fā)酵4 d時(shí)，CK組POV升高至3.44 mmol?kg-1，而5組發(fā)酵豬肉漿的POV維持在2.51—2.96 mmol?kg-1，比CK組低13.80%—27.00%。YZC3組在發(fā)酵第4天時(shí)POV為2.97 mmol?kg-1，顯著低于第2天（＜0.05），說明YZC3組在發(fā)酵2—4 d時(shí)，過氧化物的生成速度比分解速率慢，導(dǎo)致POV的降低。

圖4 豬肉漿發(fā)酵過程中POV的變化

2.6 不同菌株發(fā)酵過程中豬肉漿TBARS的變化

發(fā)酵開始時(shí)，豬肉漿的TBARS值為0.09 mg/100g，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，各組發(fā)酵豬肉漿TBARS值均呈上升趨勢(shì)。發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，CK組的TBARS值為0.33 mg/100 g，比試驗(yàn)組高29.43%—34.83%（圖5）。

2.7 基于PCA對(duì)不同發(fā)酵豬肉漿的脂質(zhì)氧化和水解的區(qū)分

圖6為不同發(fā)酵豬肉漿的PCA得分圖。該模型累計(jì)貢獻(xiàn)為83.6%，第一主成分（PC1）和第二主成分貢獻(xiàn)率分別為67.1%和16.5%。接種發(fā)酵菌株組豬肉漿與CK組位于不同象限中，說明接種發(fā)酵菌株組豬肉漿與CK組豬肉漿的脂質(zhì)氧化和水解程度、脂質(zhì)組成存在較大差異。YCC2和YCC3組位于第二象限中；YSZ11、YZC2、YZC3組位于第三象限，說明YCC2和YCC3組豬肉漿的脂質(zhì)氧化和水解程度、脂質(zhì)組成較為相似；YSZ11、YZC2、YZC3組豬肉漿的脂質(zhì)氧化和水解程度、脂質(zhì)組成較為相似。

2.8 脂質(zhì)氧化和水解的相關(guān)性分析

由圖7可知，不飽和脂肪酸的含量與TBARS值、POV呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05），相關(guān)性系數(shù)分別為-0.82和-0.85，說明脂質(zhì)的氧化主要由不飽和脂肪酸引起，不飽和脂肪酸含有雙鍵或叁鍵，在空氣中極易氧化，生成醛、過氧化物等氧化產(chǎn)物，導(dǎo)致TBARS值和POV升高[14]。分析顯示磷脂含量與游離脂肪酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)性（=-0.91，＜0.05），而中性脂質(zhì)與游離脂肪酸含量的相關(guān)性不顯著（=0.54，＞0.05），因此，磷脂是游離脂肪酸的主要來源。磷脂酶活性與磷脂的含量呈顯著負(fù)相關(guān)（= -0.89，＜0.05），與不飽和脂肪酸的含量顯著正相關(guān)（=0.81，＜0.05），說明磷脂在磷脂酶的作用下被水解生成不飽和脂肪酸；酸性脂肪酶活性與游離脂肪酸的含量呈顯著正相關(guān)（=0.81，＜0.05），說明酸性脂肪酶活力越高，生成的游離脂肪酸越多；而中性脂肪酶活性和中性脂質(zhì)的含量與游離脂肪酸含量、多不飽和脂肪酸含量相關(guān)性均不顯著（＞0.05）。

圖5 豬肉漿發(fā)酵過程中TBARS值的變化

圖6 不同發(fā)酵豬肉漿的PCA得分圖

圖7 脂質(zhì)氧化和水解的相關(guān)性熱圖

3 討論

3.1 肉漿pH和脂質(zhì)氧化

發(fā)酵過程中，pH的下降對(duì)肉制品的安全性具有重要的影響。較低pH可以抑制病原微生物和腐敗微生物的生長(zhǎng)，從而保證肉制品的安全性。本試驗(yàn)中接種發(fā)酵菌株可以降低豬肉漿的pH，是因?yàn)榘l(fā)酵過程中發(fā)酵菌株會(huì)分解碳水化合物產(chǎn)生大量的酸類物質(zhì)，導(dǎo)致pH的下降。而在發(fā)酵后期，蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生了氨、三甲胺等堿性物質(zhì)[15]，抑制發(fā)酵菌株自身的生長(zhǎng)[16]，降低了酸類物質(zhì)的生成量，從而導(dǎo)致pH下降平緩。

肉制品發(fā)酵過程伴隨著脂質(zhì)的水解，也會(huì)發(fā)生脂質(zhì)的氧化反應(yīng)。適度的脂質(zhì)氧化促進(jìn)風(fēng)味的形成，但是脂質(zhì)的過度氧化會(huì)降低產(chǎn)品品質(zhì)。脂質(zhì)氧化分為兩個(gè)過程：一是脂質(zhì)的初級(jí)氧化，生成過氧化物；二是過氧化物進(jìn)一步氧化生成醛、酮類物質(zhì)。POV反映脂質(zhì)氧化初期過氧化物和過氧化氫基團(tuán)的生成量，是評(píng)價(jià)脂質(zhì)初級(jí)氧化程度的一個(gè)重要指標(biāo)。在發(fā)酵第4天時(shí)，試驗(yàn)組POV顯著低于CK組，說明發(fā)酵菌株可以抑制脂質(zhì)初級(jí)氧化產(chǎn)物的生成。有研究表明，用于發(fā)酵食品的葡萄球菌和乳酸菌在發(fā)酵過程中可以分泌超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD），SOD具有清除超氧自由基的能力，使超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化物，過氧化物經(jīng)POD分解成水，使過氧化物的積累量保持較低水平[17]。此外，也有研究表明和在發(fā)酵香腸中可以產(chǎn)生抗氧化多肽，抗氧化肽通過對(duì)自由基的清除并代替自由基與不飽和脂肪酸結(jié)合，阻斷了自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而抑制脂質(zhì)的氧化[18]。Chen等[19]和Han等[20]的研究表明乳酸菌對(duì)超氧陰離子自由基、DPPH自由基和羥自由基具有很好的清除能力。TBARS反映脂質(zhì)二級(jí)氧化產(chǎn)物（丙二醛、醛、酮等）的積累量，是評(píng)價(jià)多不飽和脂肪酸氧化程度的重要指標(biāo)。在發(fā)酵過程中，所有組的TBARS值均呈上升趨勢(shì)，說明無論是否接種發(fā)酵劑，脂質(zhì)均出現(xiàn)不同程度的氧化。在發(fā)酵第4天時(shí)，試驗(yàn)組TBARS值顯著低于CK組，說明發(fā)酵菌株可以一定程度上抑制脂質(zhì)的氧化。Chen等[3]研究結(jié)果也顯示接種發(fā)酵菌株、、和可以降低哈爾濱干香腸的TBARS值。目前，未見對(duì)葡萄球菌和巨球菌體外抗氧化性的研究報(bào)道，而本試驗(yàn)中的2株木糖葡萄球菌、2株巨球菌、1株腐生葡萄球菌在發(fā)酵豬肉漿中均呈現(xiàn)出良好的抗氧化性，特別是菌株YCC2、YCC3。

3.2 肉漿脂肪酶活性

脂肪酶結(jié)構(gòu)屬于典型的α/水解酶折疊型，活性中心由催化三聯(lián)體Ser-His-Asp/Glu構(gòu)成，并且許多脂肪酶還有蓋子結(jié)構(gòu)[21]。發(fā)酵肉制品加工過程中，脂肪酶對(duì)脂質(zhì)的水解發(fā)揮著重要的作用。盡管有研究報(bào)道脂肪酸的釋放主要?dú)w因于肉中內(nèi)源脂肪酶[22]，但不可否認(rèn)的是微生物對(duì)脂質(zhì)的水解也起著重要作用。本試驗(yàn)中豬肉漿經(jīng)過高壓滅菌，內(nèi)源性脂肪酶失活，而在試驗(yàn)組中檢測(cè)到酸性脂肪酶、中性脂肪酶和磷脂酶的活性，說明本試驗(yàn)中的5株發(fā)酵菌株可以分泌脂肪酶，從而促進(jìn)脂質(zhì)的水解。Talon等[23]研究發(fā)現(xiàn)葡萄球菌和微球菌可以分泌脂肪酶，水解豬肉中的脂肪；Lucilla等[24]發(fā)現(xiàn)木糖葡萄球菌可分泌脂肪酶，從而促進(jìn)脂質(zhì)的水解；Selgas等[25]從西班牙干腌香腸中分離純化出3株具有降脂能力的發(fā)酵菌株并對(duì)其進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這3株菌株可以促進(jìn)不飽和脂肪酸的釋放。這些研究與本試驗(yàn)結(jié)果一致。然而，脂質(zhì)的水解程度與脂肪酶活力的大小有著密切的關(guān)系，在3種類型的脂肪酶中，酸性脂肪酶在整個(gè)發(fā)酵過程中表現(xiàn)出最高的活性，其次是磷脂酶，中性脂肪酶活力較弱，原因是脂肪酶的活性受pH影響較大[26]，中性脂肪酶最適pH為7.5，而發(fā)酵過程中，豬肉漿初始pH為5.71，并在發(fā)酵成熟過程中最終下降到3.95—5.18，而酸性脂肪酶和磷脂酶位于溶酶體內(nèi)，最適pH為酸性[3]；此外，有研究指出，在發(fā)酵過程中，脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物可以影響酶的活力[27]，因此，推測(cè)本試驗(yàn)中脂肪酸的積累進(jìn)一步加強(qiáng)了酸性脂肪酶和磷脂酶的活性，并減弱了中性脂肪酶的活性。Jin等[27]的研究也表明無煙培根加工過程中酸性脂肪酶活力最高。但是本試驗(yàn)中中性脂肪酶活力與Jin等[27]的研究結(jié)果有所差異，原因可能是其在培根中檢測(cè)到的脂肪酶活性來源于原料肉和微生物，而本試驗(yàn)檢測(cè)到的脂肪酶活性只來源于微生物。

3.3 肉漿脂質(zhì)水解

本試驗(yàn)發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，試驗(yàn)組脂質(zhì)的組成與發(fā)酵初始相比有顯著變化，且試驗(yàn)組游離脂肪酸含量顯著高于CK組，說明5株菌株可以促進(jìn)游離脂肪酸的釋放。Chen等[3]在哈爾濱紅腸中接種、和，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵菌株可以促進(jìn)脂質(zhì)水解，提高游離脂肪酸的含量，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相似；試驗(yàn)組磷脂含量與CK組相比顯著下降，而中性脂質(zhì)含量無顯著變化，說明游離脂肪酸主要由磷脂水解生成，Huang等[10]的報(bào)道表明磷脂是培根加工過程中游離脂肪酸的主要來源。SOLANGE等[28]也曾報(bào)道磷脂是干腌肉制品中脂質(zhì)水解的主要底物。磷脂的含量與磷脂酶的脂解能力密切相關(guān)，本試驗(yàn)中磷脂酶表現(xiàn)出較高活性，進(jìn)一步證明磷脂是游離脂肪酸的主要來源。

游離脂肪酸在脂肪酶的作用下生成，脂肪酸包括SFA和UFA，UFA又分為MUFA和PUFA。有研究表明，UFA具有許多重要的生理功能，特別是PUFA，不僅具有預(yù)防和治療心血管疾病，抑制動(dòng)脈硬化和降血脂的作用，還可以預(yù)防大腦衰老并提高記憶力[29-30]；本研究中試驗(yàn)組UFA含量顯著高于CK組，特別是C18:1的含量。C18:1位于甘油三酯的Sn-1和Sn-3處，該位置容易被脂肪酶水解，導(dǎo)致C18:1被大量釋放[31]。Domínguez等[32]研究商業(yè)發(fā)酵劑（，和）對(duì)干腌馬駒香腸游離脂肪酸的影響，發(fā)現(xiàn)接種發(fā)酵劑可以促進(jìn)UFA的生成；Flores等[33]對(duì)從肉制品中分離出的植物乳桿菌、木糖葡萄球菌進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)這兩株菌株可以分泌脂肪酶，進(jìn)而促進(jìn)脂質(zhì)的水解，釋放大量的脂肪酸，特別是UFA。高比例的UFA/SFA有助于促進(jìn)脂肪的消化。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組UFA/SFA的比例顯著高于CK組，與Zhao等[34]研究結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵劑（戊糖乳桿菌、戊糖片球菌和肉葡萄球菌）可以提高發(fā)酵羊肉香腸中UFA/SFA的比例。這是因?yàn)槲⑸镌诎l(fā)酵期間大量繁殖促進(jìn)SFA的降解或者促進(jìn)SFA轉(zhuǎn)化為UFA[35]。

脂質(zhì)水解和氧化是發(fā)酵酸魚風(fēng)味形成的重要途徑。通過對(duì)脂質(zhì)氧化和水解指標(biāo)相關(guān)性分析可知，肉漿發(fā)酵過程中，脂質(zhì)特別是磷脂在酸性脂肪酶和磷脂酶的作用下水解生成游離脂肪酸，游離脂肪酸（特別是不飽和脂肪酸）發(fā)生進(jìn)一步反應(yīng)生成酸、醛、酮、酯等物質(zhì)，賦予肉制品獨(dú)特的風(fēng)味[36-38]。因此，發(fā)酵風(fēng)味的不同是發(fā)酵劑的差異而導(dǎo)致生成的脂肪酸不同。同時(shí)，發(fā)酵劑的存在可以抑制肉漿的氧化程度，防止異味的產(chǎn)生。Xiao等[5]研究發(fā)現(xiàn)香腸風(fēng)味的改善得益于發(fā)酵劑（R2和A2），因?yàn)榘l(fā)酵劑可以促進(jìn)游離脂肪酸的釋放，特別是UFA，并且可以防止異味和酸敗的形成。本試驗(yàn)5株發(fā)酵菌株均提高UFA的含量和降低TBARS值和POV，對(duì)提高發(fā)酵肉制品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和改善風(fēng)味具有重要意義。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)探究了發(fā)酵菌株木糖葡萄球菌（）YSZ11和YCC3、腐生葡萄球菌（）YCC2、巨球菌（）YZC2和YZC3在豬肉漿體系中對(duì)脂質(zhì)水解和氧化的影響，發(fā)現(xiàn)接種發(fā)酵菌株的試驗(yàn)組均具有較低的POV和TBARS值，可以延緩脂質(zhì)氧化程度；試驗(yàn)組酸性脂肪酶和磷脂酶活力較高，可以促進(jìn)磷脂轉(zhuǎn)化為游離脂肪酸。脂肪酸分析顯示試驗(yàn)組中不飽和脂肪酸含量較高，尤其是棕櫚油酸和油酸，同時(shí)檢測(cè)到亞油酸和亞麻酸等多不飽和脂肪酸的存在。腐生葡萄球菌YCC2和木糖葡萄球菌YCC3具備較強(qiáng)的脂質(zhì)水解能力和抑制脂質(zhì)氧化的能力。

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Analysis of Lipolysis and Oxidation Ability of Fermentation Strains in Sterilized Pork Pulp

WANG Ji, ZHANG Xin, HU JingRong, YU ZhiHui, ZHU YingChun

College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030800, Shanxi

【】This study aimed to screen out the fermentation strains with high lipolysis and antioxidant ability, which provided the theoretical basis for development of new starter cultures.】The sterilized pork pulp was inoculated withYSZ11,YCC3,YCC2,YZC2, andYZC3, respectively. The sterilized pork pulp without inoculation of strains was used as the control group. The changes of pH, peroxide value (POV), thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), lipase activity, lipid composition and free fatty acid content were measured after 4 d fermentation.【】5 fermentation strains could reduce the pH value of the pork pulp. The POV and TBARS values were 2.51-2.96 mmol?kg-1and 0.21-0.24 mg/100g in pork pulp inoculated with fermentation strains, which were significantly lower (＜0.05) than that in CK group. The activity of neutral lipase, acid lipase and phospholipase were all detected in the groups inoculated with the fermentation strains, while higher activity of acid lipase and phospholipase were found in the groups inoculated with the fermentation strains than that of neutral lipase. After 4 d of fermentation, the phospholipid content decreased significantly (＜0.05), while the free fatty acid content increased by 21.1%-73.7% in the groups inoculated with the fermentation strains. At the same time, the amount of saturated fatty acids decreased significantly, while the amount of unsaturated fatty acids especially the content of palmitoleic (C16:1), oleic (C18:1) and linoleic acids (C18:2) increased significantly, and the linolenic acid (C18:3) was also detected. 【】This study showed that five fermentation strains could inhibit lipid oxidation, and promoted lipid hydrolysis by secreting lipase, which led to the increase of the content of free fatty acids, especially unsaturated fatty acids.YCC2 andYCC3 had better lipolysis and antioxidant ability, and showed a more prominent promoting effect on improving the quality of fermented meat products.

sterilized pork pulp; fermentation strain; lipase activity; lipolysis; lipid oxidation

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.09.013

2021-08-10；

2021-11-01

山西省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（20210302123400）、山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（201903D211008）

王吉，E-mail：17835422765@163.com。通信作者朱迎春，E-mail：yingchun0417@163.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）