生菜LsPHYB可變剪接體的克隆與高溫誘導表達模式

隋心意，趙小剛，陳鵬宇，李亞靈，溫祥珍

生菜可變剪接體的克隆與高溫誘導表達模式

隋心意，趙小剛，陳鵬宇，李亞靈，溫祥珍

山西農(nóng)業(yè)大學園藝學院，山西晉中 030801

【】光敏色素B（phytochrome，PHYB）是光和溫度的受體。通過克隆光敏色素B基因（）可變剪接體并分析其在高溫誘導下的表達模式，探究可變剪接體在生菜響應環(huán)境高溫中的生物學功能，為培育耐熱性生菜提供理論依據(jù)。采用生物信息學方法在生菜的基因組數(shù)據(jù)庫搜索獲得的cDNA序列的相關信息；對克隆得到的3個可變剪接體、和進行多序列比對、可變剪接方式分析及系統(tǒng)進化樹分析；通過在線軟件預測PHYB1、PHYB2和PHYB3蛋白分子量、等電點和親水性、疏水性等蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，并通過生物信息學軟件預測三者的二級結構、三級結構和保守結構域；采用熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測、和在高溫處理后的表達特征?？寺～@得的生菜的3個可變剪接體、和的CDS長度分別為3 509、3 877和2 690 bp，編碼氨基酸長度分別為1 094、960和853 aa。其中發(fā)生可變3′端位點和外顯子跳躍類型可變剪接，發(fā)生選擇性保留polyA尾和內(nèi)含子保留型可變剪接，發(fā)生外顯子跳躍類型可變剪接。保守結構域分析表明PHYB2的N端缺少PAS和PHY功能域；PHYB3的N端缺少PAS和PHY功能域，C端缺少HisKA功能域；系統(tǒng)進化樹分析表明，3個可變剪接體聚為一支。qRT-PCR分析表明在高溫處理第1天，的表達量最高；在高溫處理第5—9天，的表達量高于和；在高溫處理第11天，的表達量高于和，處理11 d內(nèi)三者表達量達到峰值的時間不同。高溫下生菜的轉(zhuǎn)錄本存在3個可變剪接體和。在高溫處理前期高表達，分別在高溫處理中期、后期高表達，推測生菜3個可變剪接體在抗高溫脅迫中發(fā)揮不同的作用。

生菜；；可變剪接體；高溫脅迫；響應

0 引言

【研究意義】近年來，全球氣候變暖趨勢顯著，高溫成為影響植物生長發(fā)育的重要因素[1]。生菜（L.）性喜冷涼，最適宜的生長溫度為15—20℃，高溫會導致其葉片變薄、節(jié)間伸長，直接影響商品價值[2]。前人研究表明[3]，PHYB是光和溫度的受體。本研究在克隆時發(fā)現(xiàn)其在高溫下存在可變剪接，探究可變剪接體在響應高溫中的功能對生菜的越夏栽培以及熱品種的培育具有重要的理論和實踐意義?！厩叭搜芯窟M展】可變剪接（alternative splicing，AS）是植物響應高溫脅迫的重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式[4-6]，直接決定蛋白的結構和功能[7]?？勺兗艚邮侵敢粋€前體信使RNA通過不同的剪接方式形成多個成熟mRNA亞型的過程[8]，主要有外顯子跳躍（skipped exon，SE）、內(nèi)含子保留（retain intron，RI）、可變5′端位點（alternative 5′ splice site，A5′SS）、可變3′端位點（alternative 3′ splice site，A3′SS）、外顯子互斥（mutually exclusive exon，MEE）、可變啟動子（alternative promoter）和可變polyA（alternative polyA）7種類型[9]。前人研究表明，多種植物均通過基因的可變剪接來響應高溫脅迫[10-13]。番茄（）[14]中發(fā)現(xiàn)熱激蛋白HSPs（heat shock proteins）和熱激轉(zhuǎn)錄因子HSFs（heat shock transcription factors）在高溫下發(fā)生RI和SE類型的可變剪接產(chǎn)生短截的蛋白來響應高溫。水稻（L.）干旱應答元件結合蛋白（）在高溫下通過產(chǎn)生新的可變剪接體來應對高溫脅迫[15]。甘藍（L.）在高溫脅迫下會產(chǎn)生2種可變剪接體增加對轉(zhuǎn)錄調(diào)控的復雜性，以此提高甘藍的耐熱性[16]。AIROLDI等[17]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥（）中（）在高溫下通過增加非功能型的剪接變體來促進擬南芥提前開花，以此來響應環(huán)境高溫。POSE等[18]研究表明高溫下擬南芥（）通過增加可變剪接體的表達，促進與SVP（short vegetative phase）相互作用，激活開花啟動子（）與（），進而促使其花期提前，避開高溫的不利影響。YAN等[19]研究發(fā)現(xiàn)高溫下擬南芥通過可變剪接產(chǎn)生大量microRNA 400初級轉(zhuǎn)錄本促進種子萌發(fā)和細胞伸長，進而促進植物在高溫下的生長發(fā)育。綜上所述，植物通過可變剪接改變蛋白的功能來增強對高溫的適應性。【本研究切入點】前人研究[20-21]發(fā)現(xiàn)在擬南芥中光敏色素B（phytochrome B，PHYB）不僅可以整合光信號，還可以整合溫度信號，生菜中PHYB是否也作為溫度感受器參與生菜對環(huán)境高溫的感知？此外，已有多個基因的可變剪接被鑒定并證實可以對高溫脅迫做出響應，生菜中是否也通過可變剪接響應高溫脅迫？【擬解決的關鍵問題】本研究以熱敏性生菜為試驗材料，對的可變剪接體進行克隆，鑒定其序列特征及可變剪接情況，分析其基因結構并檢測在高溫處理過程中的表達特征，比較其蛋白的結構、性質(zhì)和功能，旨在初步明確可變剪接在高溫下發(fā)揮的功能，為后續(xù)研究生菜耐熱分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗材料生菜樣品的采集于2020年10—11月在山西農(nóng)業(yè)大學園藝實驗中心進行；基因克隆試驗和基因表達試驗于2020年12月至2021年4月在山西農(nóng)業(yè)大學園藝實驗中心進行。

1.1 試驗材料及處理

供試材料為生菜（L.）品種‘GRAND RAPIDS TBR’，購買于Seminis公司。選取顆粒飽滿、無病蟲害的種子播種于裝有基質(zhì)（草炭﹕蛭石=1﹕1）的6 cm×6 cm的花盆中，于光照培養(yǎng)箱內(nèi)（光照強度30 000 lx，光照/黑暗時間為16 h/8 h，相對濕度50%）培養(yǎng)。待植株長至6葉1心后，將其分為常溫組和高溫組進行為期11 d的處理，每組包含9株。其中高溫組生長條件為：光照條件下35℃，黑暗條件下25℃，常溫組生長條件則分別為25℃和15℃。分別于第1、3、5、7、9和11天對處理1 h后的生菜取樣，采集中部葉片混合后作為一個重復，每個處理重復3次。樣品采集后用錫紙包裹并立即用液氮速凍，儲存于-80℃冰箱備用。

1.2 總RNA提取和cDNA的合成

取適量材料在液氮中研磨，按照RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒提取總RNA。采用Prime ScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為第一鏈互補鏈DNA（cDNA）。反轉(zhuǎn)錄的反應條件及程序均按照Prime ScriptTMRT reagent Kit和Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書進行，以上試劑均購自Takara公司。

1.3 LsPHYB可變剪接體的克隆

從生菜基因組數(shù)據(jù)庫（https://lgr.genomecenter. ucdavis.edu）中搜索得到的序列信息，通過premier6.0設計克隆引物。-F：5′-AACCAACA CCTCAAATCCACC-3′；-R：5′-CCAGACCAG AATCTCATTCCTAT-3′，以上述引物為模板，通過PCR法克隆目的基因。

PCR的反應體系為：2×PfuMasterMix 25.0 μL，滅菌ddH2O 50 μL，模板cDNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL。PCR擴增程序為95℃預變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。按照凝膠回收試劑盒的說明書，進行目的片段的回收，置于-20℃保存?zhèn)溆谩⒓兓驪CR產(chǎn)物連接到T載體，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞中，隨后進行陽性克隆鑒定。

通過qRT-PCR技術分析在高溫處理過程中的表達特征。根據(jù)克隆得到的序列，設計qRT-PCR引物。-F：5′-GCATAAGAAAGT GCACAACAGCC-3′和-R：5′-CGACGAACCT GGAAGAATGG-3′，用生菜作為內(nèi)參基因，引物序列為F：5′-GTGAGTGAAGAAGGGCAATG-3′和R：5′-AGTGAATTGGTTTCGAGAGC-3′，目標基因與生菜一起擴增。根據(jù)2-??CT法用Excel軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行相對表達量分析[22]。

1.4 可變剪接體的生物信息學分析

通過比對3個可變剪接體的序列與NCBI中的CDS序列，得到基因內(nèi)含子和外顯子的剪接與保留情況。使用IBS1.0.3軟件對3個可變剪接體的基因結構進行繪制；使用ExPASy- ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析蛋白的理化性質(zhì)和組成成分；采用ExPASy-ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）進行蛋白的親疏水性分析；利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）在線程序預測蛋白的保守結構域；利用SignalP 4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）對蛋白有無信號肽進行預測；利用TMHMM（http://www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對蛋白的跨膜區(qū)域進行預測；借助網(wǎng)站SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi- bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）進行蛋白的二級結構分析；使用SWISS-MODEL（https:// swissmodel.expasy.org）在線預測PHYB蛋白的三級結構；利用MEGA7.0軟件構建系統(tǒng)進化樹；利用在線軟件Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/ Cell-PLoc-2）和Softberry（http://www.softberry.com）對該蛋白質(zhì)的亞細胞定位進行預測。

2 結果

2.1 LsPHYB的克隆與可變剪接分析

基于NCBI數(shù)據(jù)庫中生菜基因（Gene ID: 111911925）的mRNA序列信息，序列比對發(fā)現(xiàn)克隆得到的3個不同轉(zhuǎn)錄本均是的可變剪接體，將其分別命名為、和，根據(jù)比對結果繪制各轉(zhuǎn)錄本的基因結構圖（圖1）。NCBI數(shù)據(jù)庫中CDS長度為3 569 bp，由4個外顯子和3個內(nèi)含子構成。與相比，CDS長度為3 509 bp，第3個外顯子由于發(fā)生A3′SS類型的可變剪接而缺少了一段大小為29 bp的片段，第4個外顯子由于發(fā)生SE類型的可變剪接而缺失；CDS長度為3 877 bp，第2和第3內(nèi)含子發(fā)生RI類型的可變剪接，此外polyA尾也被保留；3 CDS長度為2 690 bp，第3個外顯子和第4個外顯子由于發(fā)生SE類型的可變剪接而缺失。

2.2 LsPHYB可變剪接體的生物信息學分析

2.2.1 理化性質(zhì)分析 通過ExPASy-ProtParam分析發(fā)現(xiàn)，PHYB1、PHYB2和PHYB3蛋白的氨基酸長度分別為1 094、960和853 aa；理論等電點分別為5.78、5.69和5.72，均屬于酸性蛋白質(zhì)；3個PHYB總平均親水性（GRAVY）分別為-0.123、-0.139和-0.115，均為負值，表明三者均為親水性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)分別為46.97、48.24和47.25，均大于40，表明三者均為不穩(wěn)定性蛋白。PHYB均無典型的信號肽區(qū)域，無跨膜螺旋結構域，均不屬于分泌蛋白。利用ExPASy- ProtScale預測PHYB的親水性、疏水性發(fā)現(xiàn)，三者的氨基酸疏水值最高峰均在第348位，分值為2.822；親水值最低峰均在第543位，分值為-3.311（圖2）。

黑色線段表示內(nèi)含子，淺灰色方框表示外顯子；深灰色方框表示可變剪接保留的內(nèi)含子

圖2 PHYB1、PHYB2和PHYB3蛋白親水性、疏水性分析

2.2.2 二級和三級結構分析 3種PHYB蛋白序列均由-螺旋（-helix）、延伸鏈（extended strand）、無規(guī)則卷曲（random coil）和-轉(zhuǎn)角（-turn）組成。其中PHYB2蛋白所含-螺旋比例最高，為49.06%；PHYB3蛋白所含無規(guī)則卷曲、延伸鏈和-轉(zhuǎn)角比例均最高，分別為35.76%、13.72%和5.63%（圖3）。3個PHYB蛋白的三維結構整體十分相似，但是三者在C端上存在差異。

2.2.3 保守結構域分析 PHYB1蛋白結構完整，即N端具有Per-Arnt-Sim（PAS）、cGMP磷酸二酯酶-腺苷酸環(huán)化酶-FhlA（cGMP phosphodiesterase-adenylylcyclase- FhlA，GAF）和PHY特異性（PHY-specific，PHY）結構域，C端具有2個連續(xù)的PAS和組氨酸激酶相關（histidine kinase A，HisKA）結構域；與PHYB1蛋白相比，PHYB2蛋白的N端缺少PAS和PHY功能域；PHYB3蛋白不僅N端缺少PAS和PHY功能域，而且C端還缺少HisKA功能域（圖4）。

圖3 PHYB1、PHYB2和PHYB3蛋白的二級結構特征

圖4 PHYB1、PHYB2和PHYB3蛋白結構域示意圖

2.2.4 系統(tǒng)進化分析 利用MEGA7.0將3種PHYB氨基酸序列與向日葵（，NC_ 035433.2）、煙草（，NW_015887446.1）、擬南芥（，NC_003071.7）、甘藍（L.，NC_027752.1）、蕪菁（，NC_024799.2）、番茄（，NC_015442.3）、馬鈴薯（，NW_ 006239191.1）和菠菜（，NW_018932796.1）進行序列比對并構建系統(tǒng)進化樹。結果表明LsPHYB的3個可變剪接體首先聚為一個分支，與同為菊科的向日葵進化距離最近，與十字花科的擬南芥、甘藍和蕪菁進化距離較近；與茄科的煙草、番茄和馬鈴薯進化距離較遠；與藜科的菠菜進化距離最遠（圖5）。

2.3 LsPHYB可變剪接體在高溫處理下的表達特征分析

與對照相比，高溫處理下的表達量均高于對照，且在處理后第1、3、5和9天的表達量均顯著高于對照，第11天時表達量最高，為常溫下表達量的5倍。與對照相比，在處理第5、7和11天的表達量顯著高于常溫，第5天時表達量最高，為常溫下表達量的4.3倍。與對照相比，在第3和11天高溫下的表達量均顯著低于對照；在第1、5、7和9天均高于對照，且在第1、5和9天差異顯著；第1天時表達量最高，為常溫下表達量的1.75倍。綜上，處理11 d內(nèi)，三者表達量達到最大峰值的時間不同，高溫處理第1天，的表達量最高；高溫處理第5—9天，的表達量高于和；高溫處理第11天，的表達量高于和（圖6）。

Ha：向日葵Helianthus annuus，NC_035433.2；Nt：煙草Nicotiana tabacum，NW_015887446.1；At：擬南芥Arabidopsis thaliana，NC_003071.7；Bo：甘藍Brassica oleracea，NC_027752.1；Br：蕪菁Brassica rapa，NC_024799.2；Sl：番茄Solanum lycopersicum，NC_015442.3；St：馬鈴薯Solanum tuberosum，NW_006239191.1；So：菠菜Spinacia oleracea，NW_018932796.1

*表示差異顯著（P＜0.05） * indicate significant difference (P＜0.05)

3 討論

3.1 LsPHYB可變剪接體序列分析

可變剪接可能會導致蛋白的結構和功能發(fā)生變化，例如，A3′SS和RI可導致轉(zhuǎn)錄本插入提前終止密碼子（premature termination codon，PTC），具有PTC的轉(zhuǎn)錄本可被翻譯成短截的蛋白質(zhì)[23]；SE類型可變剪接會因缺少必須的結構域而形成非功能性蛋白[24]。因此，可變剪接會改變PHYB1、PHYB2和PHYB3蛋白的功能域，從而導致三者的結構和功能發(fā)生變化。

蛋白質(zhì)的功能與結構密切聯(lián)系，結構域的差異會導致其功能活性方面發(fā)生較大的變化[25]。通過比較三者保守結構域發(fā)現(xiàn)，PHYB2和PHYB3的N端均缺少PAS和PHY功能域。PAS和PHY功能域可促進無活性的紅光吸收型Pr（phytochrome R-absorbing form）和具有生物活性的遠紅光吸收型Pfr（phytochrome FR-absorbing isomer）之間的轉(zhuǎn)化并維持Pfr的穩(wěn)定性[26-28]。因此，推斷高溫下缺少PAS和PHY功能域的PHYB2和PHYB3不能從Pr轉(zhuǎn)化為Pfr，進而無法從細胞質(zhì)移向細胞核并與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子相互作用[29]。此外，PHYB3蛋白C端還缺少HisKA功能域，前人研究表明HisKA功能域可通過與下游轉(zhuǎn)錄因子相互作用來參與光信號轉(zhuǎn)導[30]，并且發(fā)現(xiàn)去除HisKA功能域后可加速從Pfr到Pr的熱轉(zhuǎn)換，降低了活性Pfr的數(shù)量[20,31]，推測高溫下生菜通過可變剪接改變PHYB2和PHYB3蛋白的功能。

常溫條件下照光后，從Pr向Pfr轉(zhuǎn)化時，PHY結構域由延伸鏈變?yōu)?螺旋，使PHY結構域與GAF結構域接觸[32]。二級結構分析發(fā)現(xiàn)，高溫下PHYB3的延伸鏈比例升高，推測延伸鏈比例升高將減少PHY結構域與GAF結構域的接觸，導致PHYB3在高溫下主要以Pr形式存在，影響PHYB與下游轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，進而提高擬南芥對高溫的適應性[33]。

3.2 LsPHYB可變剪接體在高溫脅迫下的功能分析

目前，關于表達特征的研究主要集中在響應光周期特點及在不同光照條件下組織特異性表達方面[34]，而在響應溫度的表達特征方面的研究較少。本研究中，生菜3個可變剪接體表達量達到峰值的時間不同，缺少PAS、PHY和HisKA功能域蛋白亞型的在高溫處理第1天表達量最高，之后逐漸降低；而功能域完整的和產(chǎn)生缺乏PAS和PHY功能域蛋白亞型的在高溫處理中后期高表達。LIU等[35]研究發(fā)現(xiàn)黃瓜赤霉素代謝關鍵酶Gibberellin 2-beta-dioxygenase8（CsGA2ox8）在強光下通過可變剪接產(chǎn)生“無功能”轉(zhuǎn)錄本CsGA2ox8.2來維持幼苗生長所必須的內(nèi)源赤霉素濃度。WU等[36]研究發(fā)現(xiàn)百合（spp.）在高溫下通過產(chǎn)生可變剪接體增強對鹽脅迫和高溫脅迫的耐受性。因此，推測的3個剪接體在生菜響應環(huán)境高溫過程中發(fā)揮著重要功能。

前人研究表明PAS、PHY和HisKA功能域的缺失將導致PHYB無法進入細胞核[37-38]，而PHYB的核定位對其發(fā)揮生物學功能具有重要作用[39]。另外，有研究表明可變剪接可以通過改變轉(zhuǎn)錄本編碼蛋白的亞細胞定位影響其生物學功能[40-41]，是否通過可變剪接改變蛋白的細胞定位來影響其功能？缺乏功能域的PHYB2和PHYB3蛋白能否正常進入細胞核內(nèi)發(fā)揮作用？這些都有待后續(xù)深入研究。

4 結論

克隆了生菜的全長cDNA序列，該基因存在3個可變剪接體、和，分別編碼功能域完整的PHYB1蛋白，缺失PAS和PHY功能域的PHYB2蛋白和缺失PAS、PHY和HisKA功能域的PHYB3蛋白。在高溫處理前期高表達，和分別在高溫處理中、后期高表達，推測生菜3個可變剪接體在抵抗高溫脅迫中發(fā)揮不同的作用。

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Cloning of Alternative Splice Variants ofin Lettuce and Its Expression Patterns Under Heat Stress

SUI XinYi, ZHAO XiaoGang, CHEN PengYu, LI YaLing, WEN XiangZhen

Horticulture College, Shanxi Agricultural University, Jinzhong 030801, Shanxi

【】Phytochrome B (PHYB) is a receptor for both light and temperature. In this study, the biological functions of alternative splice variants ofin lettuce in response to high environmental temperatures were investigated through cloning them and analyzing their expression patterns, so as to provide a theoretical basis for breeding heat-tolerant lettuce.【】The cDNA sequences ofwere searched from the genomic database of lettuce by bioinformatics method. The clonedandwere subjected to multi-sequence alignment, alternative splice variants form analysis and phylogenetic analysis. Protein properties, such as molecular weight, theoretical isoelectric point, hydrophilicity and hydrophobicity, were predicted by online software. Secondary structure, tertiary structure and conserved domains were analyzed by bioinformatics software. Three alternative splice variants were characterized for expression after high temperature treatment by RT-PCR. 【】There were three alternative splice variants ofobtained by cloning, namely,and, with their CDS lengths of 3 509, 3 877 and 2 690 bp, which encoded 1 094, 960 and 853 amino acids, respectively. Alternative splice forms ofwere alternative 3′ splice site and skipped exon. Alternative splice forms ofwere alternative polyA and retain intron. An alternative splice form ofwas skipped exon. Conserved structural domain analysis showed that the N-terminal of PHYB2 lacked the PAS and PHY domains. The N-terminal of PHYB3 lacked the PAS and PHY domains, and its C-terminal lacked the HisKA domain. Phylogenetic analysis showed that three alternative splice variants were clustered into a clade.qRT-PCR analysis showed that the expression ofwas the highest at the first day of high temperature treatment;had higher expression thanandat days 5-9 of high temperature treatment; at day 11 of high temperature treatment, the expression ofwas higher than that ofand. The three alternative splice variants peaked at different times during the 11 days of high temperature treatment. 【】There were three alternative transcript variants of, named,andB3.expression was the highest in the early stage of high temperature treatment,in response to high temperature stress.

lettuce;; alternative splice variants; heat stress; response

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.09.011

2021-09-06；

2021-12-04

山西省重點研發(fā)計劃（201803D221001-1）

隋心意，E-mail：sui821793836@163.com。趙小剛，E-mail：1185178867@qq.com。隋心意和趙小剛為同等貢獻作者。通信作者溫祥珍，E-mail：330821473@qq.com

（責任編輯 趙伶俐）