平歐榛子分離蛋白提取條件優(yōu)化

魏雅靜，楊 宇，祝開陽

（阜新市產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新推廣中心（阜新市產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院），遼寧阜新 123000）

榛子是世界四大干果之一，營養(yǎng)豐富，果仁中含有B族維生素、人體必需氨基酸、多種礦物質(zhì)元素、高含量蛋白質(zhì)和豐富的脂肪等成分[1]。平歐榛子是由平榛與歐洲榛種間雜交產(chǎn)生的新品種，具有果大、豐產(chǎn)、抗寒性強和果仁質(zhì)量好等特點[2]。

常用的蛋白質(zhì)提取方法有水溶液提取、堿溶酸沉[3]、有機溶劑提取及酶法提取等。其中堿溶酸沉法由于操作簡單、容易控制、成本低廉應(yīng)用最廣泛，且所得產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量較高，經(jīng)濟實用性強，因此試驗采用堿溶酸沉法提取平歐榛子蛋白質(zhì)，以蛋白提取率為指標(biāo)，得到榛子分離蛋白最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平歐榛子，購于本溪縣三陽大果榛子專業(yè)生產(chǎn)合作社?？捡R斯亮藍G-250，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛血清白蛋白，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；鹽酸、氫氧化鈉、硫酸、甲基紅、溴甲酚綠、乙醇、石油醚（30～60 ℃）和正己烷均為分析純，購于國藥集團。

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-25數(shù)顯pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDL-40B臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠制造；DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏飾演設(shè)備有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；FD-IC-80高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有公司；SHA-C恒溫振蕩器，國華電器有限公司；DSA30-TM1超聲波清洗器，福州德森精工有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

去殼后的榛仁室溫靜水浸泡15 h，去皮，50 ℃烘箱烘干，粉碎機破碎后過40目篩。料液比1∶5（g∶mL）加入正己烷，50 ℃超聲波提取30 min，4 000 r/min離心20 min，倒去正己烷（回收利用），殘留的正己烷在通風(fēng)櫥中揮發(fā)，按照上述步驟重復(fù)提取一次得到榛子脫脂粉，放入-20 ℃冰箱中備用。

1.3.2 可溶性蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍測定可溶性蛋白質(zhì)含量[4]。配制不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（Bovine Serum Albumin，BSA）溶液，加入考馬斯亮藍G-250充分混合，在595 nm處測吸光值，繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，利用回歸方程求出樣品蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 榛子分離蛋白的制備

榛子分離蛋白的制備采用堿溶酸沉法。脫脂榛子粉與去離子水以一定比例混合均勻，用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH，在恒溫振蕩水浴中浸提一段時間，5 000 r/min離心20 min，收集上清液，用1 mol/L HCl調(diào)至等電點5 000 r/min離心20 min，棄上清液，冷凍干燥得榛子分離蛋白[5]。榛子蛋白質(zhì)提取率計算：

式中：M為脫脂榛子粉質(zhì)量，g；Mt為上清液中蛋白質(zhì)含量，g；C為脫脂榛子粉中蛋白質(zhì)含量，%。

1.3.4 單因素試驗

以蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，對影響蛋白質(zhì)提取率的主要因素pH（7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0），溫度（35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃），時間（30 min、40 min、50 min、60 min、70 min和80 min），料液比（1∶8、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30）（g∶mL）進行單因素試驗?；A(chǔ)水平設(shè)置為pH為9.0、溫度50 ℃、提取時間60 min、料液比1∶15（g∶mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)回歸方程

如圖1所示，利用蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算回歸方程為y=6.72x+0.149，R2=0.996 9，表明方程線性擬合度良好，可以運用此方程作為測定蛋白質(zhì)含量的依據(jù)。

圖1 蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 榛子分離蛋白提取工藝單因素分析

2.2.1 pH值對榛子分離蛋白提取率的影響

如圖2所示，在pH在7.5～9.0，隨著pH的升高，蛋白提取率逐漸升高，這可能是因為堿液使蛋白質(zhì)中的部分化學(xué)鍵尤其是氫鍵遭到破壞，基團解離，導(dǎo)致蛋白質(zhì)中緊密結(jié)構(gòu)變得松散，促進蛋白質(zhì)分子的溶出[6]。當(dāng)pH為9.0時，提取率達到最高值為72.77%。之后蛋白質(zhì)提取率明顯下降，這可能是因為高pH環(huán)境會使氨基酸殘基發(fā)生異構(gòu)化，形成外旋混合物，同時堿性過高會導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生變性，水溶性降低。因此提取榛子分離蛋白最佳pH為9.0。

圖2 pH值對榛子分離蛋白提取率的影響

2.2.2 溫度對榛子分離蛋白提取率的影響

如圖3所示，35～50 ℃條件下，隨著溫度的升高，蛋白提取率呈上升趨勢，當(dāng)溫度為50 ℃時，達到最高值為73.15%。這可能是因為溫度較低時蛋白質(zhì)分子和水分子不能充分進行相互作用，溫度逐漸上升，二者之間相互作用加強，蛋白質(zhì)的溶解度隨之提高，提取率也相應(yīng)提高。50 ℃以后蛋白提取率與溫度呈負(fù)相關(guān)，這可能是因為過高的溫度使部分蛋白質(zhì)發(fā)生變性而聚集沉淀，影響蛋白質(zhì)溶出率，且高溫可能會增強榛子脫脂粉中碳水化合物等成分的黏性，促使其與蛋白質(zhì)發(fā)生黏合，從而使榛子分離蛋白的提取率下降[7]。因此提取榛子分離蛋白最佳溫度為50 ℃。

圖3 溫度對榛子分離蛋白提取率的影響

2.2.3 提取時間對榛子分離蛋白提取率的影響

如圖4所示，當(dāng)提取時間從30 min增加到60 min，蛋白提取率明顯提高，從54.42%提高到72.14%，這是因為在初提階段，榛子分離蛋白沒有完全溶解，隨著提取時間的延長，蛋白的溶出量逐漸增加，提取時間為60 min時蛋白溶出接近飽和狀態(tài)，增加提取時間，也只能溶出很少的蛋白質(zhì)。因此，后來隨著提取時間的延長，榛子分離蛋白的提取率增加緩慢，并且提取時間過長，產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量受到影響，為了保證產(chǎn)品質(zhì)量、節(jié)約能源、降低成本，確定最佳提取時間為60 min。

圖4 提取時間對榛子分離蛋白提取率的影響

2.2.4 料液比對榛子分離蛋白提取率的影響

如圖5所示，當(dāng)料液比（g∶mL）在1∶8～1∶15，提取率增長速度較快，當(dāng)料液比為1∶15（g∶mL）時達到73.89%。這可能是因為當(dāng)料液比較小時，溶液的黏度大，分子間的阻力比較大，影響蛋白質(zhì)的溶出速率，隨著料液比的增加，水分子與蛋白質(zhì)分子接觸面積增大，從而促進了蛋白質(zhì)的溶解。之后，隨著料液比的繼續(xù)增加，蛋白質(zhì)的提取率增加緩慢。這可能是因為大部分蛋白質(zhì)已經(jīng)基本溶出，在現(xiàn)有的條件下，即使料液比繼續(xù)提高，對蛋白質(zhì)的溶解也無明顯提高的作用。陶健[8]在蕎麥蛋白的制備中發(fā)現(xiàn)，料液比較大時，在酸沉過程中有大量蛋白質(zhì)從粗蛋白母液流失到乳清中，若母液中蛋白質(zhì)濃度過低，會使酸沉現(xiàn)象不發(fā)生，并且料液比過大會增加生產(chǎn)成本，考慮到節(jié)省資源、降低成本和保證酸沉工序正常進行，以料液比1∶15（g∶mL）作為最佳提取蛋白的比例。

圖5 料液比對榛子分離蛋白提取率的影響

3 結(jié)論

試驗以平歐榛子為原料，通過堿溶酸沉法提取平歐榛子分離蛋白，最終優(yōu)化條件為pH值9.0，溫度50 ℃，提取時間60 min，料液比1∶15（g∶mL），平行測定3次，取平均值。在此條件下蛋白質(zhì)提取率最高為73.64%。