促黑曲霉產糠醛和五-羥甲基糠醛的誘導子篩選及優(yōu)化

丁軒　劉建蕊　楊青青　冉麗　鄭姚佩　田羽　韋永琴　劉維芳　李祝

摘要：本試驗利用10種生物誘導子和6種非生物誘導子提高黑曲霉（Aspergillus niger）xj發(fā)酵液中糠醛和5-羥甲基糠醛（5-HMF）的產量。先采用單因素試驗篩選誘導子及誘導條件，再設計Box-Behnken試驗并結合響應面法優(yōu)化得到最佳的誘導條件。結果表明：將黑曲霉xj的種子液與誘導子一同接入發(fā)酵培養(yǎng)基，加入0.675%還原糖濃度為10 μg/mL的金葡萄球菌代謝產物誘導子，誘導8.6 h，此時發(fā)酵液中糠醛的產量為50.49 μg/mL，相較優(yōu)化之前糠醛的含量提高了37%;而在此條件下發(fā)酵液中5-HMF的產量為41.12 μg/mL，提高了31%。該試驗結果可為后續(xù)黑曲霉發(fā)酵產糠醛和5-HMF提供參考。

關鍵詞：糠醛;5-羥甲基糠醛;黑曲霉;誘導子;響應面優(yōu)化

中圖分類號：Q939文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2022）03-0034-08國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2022.03.005

糠醛（Furfural）是一種重要的生物質平臺化合物，其分子結構中含有呋喃環(huán)和醛基，化學性質活潑，可作為多種化學產品的起始原料，廣泛應用于醫(yī)學、食品、化工、能源等領域[1-3]。張素等[4]、趙妗頤等[5]試驗發(fā)現(xiàn)黑曲霉xj菌株粗提物中對齊整小核菌和鏈格孢菌具有拮抗作用的物質可能是糠醛，說明糠醛可能具有抑菌作用。目前生產糠醛主要是酸水解法，戊糖經酸催化環(huán)化脫水形成，而大多含有戊糖的物質都可作為原材料生產糠醛[6]。五-羥甲基糠醛（5-Hydorxymethylfurfural，簡寫為5-HMF），因其具有呋喃環(huán)、醛基及羥基，所以穩(wěn)定性差、性質活潑，是一種重要的平臺化學物?？赏ㄟ^縮合反應、氧化反應、氫化反應和縮醛等反應，合成多種具有高附加價值的衍生物如2，5-二呋喃甲醛（DFF）、五-?；匪幔℉MFCA）等。5-HMF的眾多衍生物可作為有機導體、生物燃料，在醫(yī)藥方面具有抗癌細胞增值活性，降血糖等藥理作用[7-10]。馬明超等[11]展示了許多制備5-HMF的方法，其中葡萄糖轉化制備 5-HMF的方法達到72%的產率。雖然目前生產糠醛和5-HMF的方法眾多，但仍存在產率較低、生產資源浪費等情況。

黑曲霉（Aspergillus niger）屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科，是絲狀真菌中一個常見真菌[12-13]。具有生長旺盛、發(fā)酵周期短、不產生毒素等特點，屬于GRAS菌種，是應用于食品工業(yè)上發(fā)酵和生產酶制劑的主要菌種[14]。黑曲霉的基因組中發(fā)現(xiàn)了大量與次級代謝有關的基因簇，可以產生多種次級代謝產物[15]，關麗萍等[16]在海洋真菌Aspergillus niger 2HL-M -8的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)11個黑曲霉的次級代謝產物。因其具有高產、高分泌、高安全性等優(yōu)點而被廣泛地應用于發(fā)酵工業(yè)中，其中黑曲霉已被用于規(guī)?；罅堪l(fā)酵生產檸檬酸。

目前提高次級代謝產量的方法主要有菌株選育、發(fā)酵優(yōu)化、微生物共培養(yǎng)[17-19]。誘變選育菌株[17]包含化學誘變、物理誘變以及復合誘變。在誘變選育中常使用2種以上的誘變方法復合誘變提高誘變效應;發(fā)酵優(yōu)化[18]為發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化和培養(yǎng)條件的優(yōu)化;而微生物共培養(yǎng)發(fā)酵[19]可以使活性粗提取物增加、促進次級代謝產量的提高以及誘導新的次級代謝物的合成，還可誘發(fā)原次級代謝物的類似物的共同途徑。除以上三種提高次級代謝產物的方法外，目前誘導子也廣泛應用于提高次級代謝產量。

誘導子（Elicitor）最初定義為可誘導植物細胞產生和積累植保素的化學物質[20]，但隨著誘導子的應用領域擴大，發(fā)現(xiàn)誘導子是一類可以特異激活植物或微生物產生次生代謝產物的活性物質[21-22]。目前誘導子已廣泛應用于提高植物中次級代謝產物的產量且誘導機制較成熟透徹[23-25]。而誘導子在微生物方面的應用主要是關于促進納他霉素的產量，試驗發(fā)現(xiàn)產黃青霉代謝產物誘導子和黑曲霉代謝產物誘導子對產納他霉具有較好的促進作用[26-27]。目前將誘導子用于提高黑曲霉次級代謝產量的研究很少見，本試驗主要利用誘導子來提高黑曲霉產生次生代謝產物—糠醛和5-HMF的產量，以便為后續(xù)的黑曲霉發(fā)酵產糠醛和5-HMF提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試驗菌種

黑曲霉（Aspergillus niger）xj，由貴州大學真菌資源研究所分離[5]，現(xiàn)于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保存（CCTCC No：M206021）。

1.1.2培養(yǎng)基及試劑

馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PDB）;馬鈴薯固體培養(yǎng)基（PDA）;LB培養(yǎng)基;0.1%吐溫-80溶液。

1.2試驗方法

1.2.1誘導子的制備

1.2.1.1誘導子類型

本次試驗以10種生物誘導子（表1）和6種非生物誘導子CuSO₄、苯甲酸鈉、氨基寡糖素、抗壞血酸、苯丙氨酸、色氨酸為篩選目標。

1.2.1.2非生物誘導子的制備

參考聶麗[28]的試驗方法，將上述非生物誘導子配成濃度為10 μg/mL的溶液，經0.45 μm濾膜后得到的溶液即為非生物誘導子。

1.2.1.3生物誘導子的制備

采用凍融研磨法制備生物誘導子。除微生物的培養(yǎng)方式不同外，其余步驟與聶麗[28]相同，改動如下。

真菌誘導子：用打孔器分別將鏈格孢菌（Alternaria alternata）、煙草疫霉（Phytophthora nictotianae）、齊整小核菌（Sclerotium rolfsis）制成菌餅后，分別接種到PDB 培養(yǎng)基（100 mL/250 mL）中，于28 ℃，180 r/min 培養(yǎng)7 d，其中齊整小核菌28 ℃靜止培養(yǎng)7 d，過濾收集菌體。將收集的菌體參照聶麗[28]的凍融研磨法制備誘導子，后置于4 ℃冰箱中備用。

細菌誘導子：分別將青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）、根癌農桿菌（Agrobacterium tume faciens）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora）接種到LB培養(yǎng)基（100 mL/250 mL）中30 ℃，150 r/min培養(yǎng)2 d;大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）接種到LB培養(yǎng)基中，于37 ℃，180 r/min培養(yǎng)2 d，10000 r/min離心10 min 收集菌體。收集到的菌體同真菌誘導子制備方法一致。

1.2.1.4生物誘導子還原糖含量的測定

以還原糖含量作為生物誘導子質量濃度的指標，采用3，5 一二硝基水楊酸（DNS）比色法測定其還原糖含量。參照趙凱等[29]試驗利用DNS比色法測定還原糖濃度，選取DNS試劑2在波長為550 nm處測定。

1.2.2黑曲霉種子液的生長曲線

將活化的黑曲霉接種于PDA培養(yǎng)基中，于26 ℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，用適量的0.1%吐溫-80無菌溶液洗下孢子。參照袁洪威等[30]的試驗方法用分光光度計測定黑曲霉孢子懸浮液濃度。制備濃度為10⁷CFU/mL孢子懸浮液，以6%的接種量加入種子培養(yǎng)基（50 mL/250 mL）中。培養(yǎng)8 d，每24 h取樣測定菌體干重。

1.2.3發(fā)酵液中糠醛和5-HMF含量的測定

1.2.3.1建立糠醛和5-HMF標準曲線模型

試驗方法參照彭秋菊等[31]和張素等[32]用HPLC法測定黑曲霉發(fā)酵液中五-羥甲基糠醛和糠醛的含量，建立糠醛和5-HMF的標準曲線。

1.2.3.2發(fā)酵液中糠醛和5-HMF含量的測定

參照彭秋菊等[31]和張素等[32]用HPLC法測定黑曲霉發(fā)酵液中糠醛和5-HMF的含量。稍有改動，改動如下：將斜面培養(yǎng)基中的黑曲霉活化，制成10⁷CFU/mL孢子懸浮液，將孢子懸液以8%～12%（V/V）接種于發(fā)酵瓶中培養(yǎng)7 d。發(fā)酵液處理方法以及色譜條件與彭秋菊等[31]試驗一致。

1.2.4誘導子篩選及優(yōu)化

主要以發(fā)酵液中糠醛含量為評價指標，將處于對數(shù)生長末期的種子液按6%的接種量加入發(fā)酵培養(yǎng)基（50 mL/250 mL）中，在此基礎上進行單因素試驗設計。

1.2.4.1誘導子種類及最佳添加時間的篩選

將濃度為10 μg/mL的氨基寡糖素、抗壞血酸、苯丙氨酸、色氨酸和濃度為10 μmol/mL的CuSO₄和苯甲酸鈉，還原糖濃度為10 μg/mL的生物誘導子以1%的添加量，在誘導時間為72 h的條件下，添加時間設為0 d、3 d、5 d，測糠醛和5-HMF的含量。以糠醛含量為指標，篩選最佳誘導子及最佳添加時間。以不添加誘導子為空白對照。

1.2.4.2誘導子添加量的篩選

在誘導子為10 μg/mL SAE，添加時間為0 d，誘導時間為72 h的條件下，添加量設為1%、2%、4%、6%、8%、10%，測糠醛和5-HMF含量。

1.2.4.3誘導子誘導時間的篩選

在添加量為1%的10 μg/mL SAE，添加時間為0 d的條件下，誘導時間設為12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h，測糠醛和5-HMF含量（誘導時間從誘導子加入后開始計算，而發(fā)酵時間針對空白對照，包含添加時間）。1.2.5響應面優(yōu)化發(fā)酵條件

根據(jù)單因素試驗結果，選取最佳條件作為0因素水平，設計三因素三水平的Box-Behnken試驗（表2）。利用Design-Expert軟件設計Box-Behnken試驗方案，以黑曲霉發(fā)酵液中的糠醛產量為響應指標進行響應面分析，預測誘導子在黑曲霉發(fā)酵體系中的最佳誘導條件。（因為最佳添加時間為0 d，左邊已是極值，故選用1d為0水平）

2結果與分析

2.1還原糖的標準曲線

利用DNS法測定還原糖濃度（即生物誘導子質量濃度）。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標，OD值為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線，其線性回歸方程為y=0.4957x-0.0088（R²=0.998），葡萄糖含量在0～1.2 mg之間，具有良好線性關系。

2.2黑曲霉在種子培養(yǎng)基中的的生長曲線

將濃度為10⁷CFU/mL孢子懸浮液以6%的接種量接入種子培養(yǎng)基，裝液量為50 mL/250 mL。由圖1可知，經過3 d培養(yǎng)后菌種生物量最大，即將進入穩(wěn)定期，可將對數(shù)生長期末期（3 d）的培養(yǎng)液作為種子液，進行發(fā)酵試驗。

2.3糠醛和五羥甲基糠醛的標準曲線

利用HPLC法測定糠醛和5-HMF的標準曲線，其中糠醛的標準曲線線性回歸方程為y=57.582x+195.82（R²=0.999）。5-HMF的標準曲線線性回歸方程為y=72.107x-11.357（R²=0.999）。兩個方程在0～60 μg/mL濃度范圍具有良好線性關系。

2.4誘導子種類及誘導時間篩選

分別向已培養(yǎng)0 d、3 d、5 d的發(fā)酵培養(yǎng)液中添加10種生物誘導子及6種非生物誘導子。其中非生物誘導子對于黑曲霉的作用效果不明顯，但生物誘導子有較明顯的作用效果。綜合圖2-4來看，相比于CK培養(yǎng)基液中的糠醛產量，0 d添加的ATFE、SAE、AAE、PNE具有促進作用。其中SAE的誘導效果最佳，其余誘導子對糠醛產量均表現(xiàn)為抑制作用，其中PNE對菌體的生長也具有抑制作用;在3 d時添加誘導子均表現(xiàn)為促進作用;在5 d時添加誘導子較0 d糠醛的產量減少?？芍? d添加SAE效果顯著優(yōu)越，糠醛含量達47.44 μg/mL，較空白對照（CK）提升了19.18 μg/mL;5-HMF含量達38.59 μg/mL，較空白對照提高了16.50 μg/mL。故選擇最佳誘導子為SAE，最佳添加時間為0 d。

2.5誘導子最佳添加量的篩選

在誘導子為10 μg/mL SAE，添加時間為0 d，誘導時間為72 h的條件下，添加量按1%、2%、4%、6%、8%、10%與黑曲霉種子液一起加入發(fā)酵液中，測定糠醛和5-HMF的含量。由圖5可知，1%的添加量產生糠醛含量較高，其余濃度對產糠醛影響不大，故選取1%為最佳添加量。

2.6誘導子最佳誘導時間的篩選

在添加量為1%的10 μg/mL SAE，添加時間為0 d的條件下，誘導培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h（從加入誘導子時間開始計算）。由圖6可知，誘導子時間為12 h對促進黑曲霉產生糠醛含量最大達到53.22 μg/mL;5-HMF含量達42.46 μg/mL。故最佳誘導時間為12 h。

2.7響應面法優(yōu)化誘導條件

2.7.1響應面的模型建立與統(tǒng)計分析

確定單因素的最佳值后，進行Box-Behnken試驗，以發(fā)酵液中的糠醛（Y）的產量為響應值，誘導子的添加時間（A）、添加量（B）以及誘導時間（C）為變量，進行響應面優(yōu)化試驗，結果如表3所示。

根據(jù)表3的試驗結果，利用Design Expert 8對數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到糠醛的回歸方程：Y₁=42.71-13.2A-0.15B-1.09C+0.47AB+1.01AC+0.59BC-5.66A²-1.02B²-7.73C2。

由表4可知，添加時間（A）的一次項和誘導時間的二次項（C²）對發(fā)酵液中糠醛的產量影響具有極顯著性（P<0.01），添加時間的二次項（A²）對發(fā)酵液中糠醛的產量影響具有顯著性（P<0.05），其余的變量影響不顯著（P>0.05）。根據(jù)α=0.05的顯著水平除去不顯著因素后，將回歸方程簡化為Y₁=42.71-13.2A- 5.66A²-7.73C²。該回歸方程的變量與因變量之間的線性關系顯著（R²=0.9467），模型調整復相關系數(shù)為R²_Adj=0.8782，說明該模型可以解釋87.82%響應值的變化，擬合程度較好[33]。

2.7.2響應面分析及優(yōu)化

利用Design Expert根據(jù)回歸方程進行響應面分析，尋找糠醛產量最大的誘導條件。響應面的陡峭程度可以表明變量對因變量的影響程度，響應面越陡峭說明相關因素影響效果越明顯。由圖7可知，三個因素對黑曲霉產糠醛的影響表現(xiàn)為：添加時間（A）>誘導時間（C）>添加量（B）。對模型進行分析，得到最優(yōu)的培養(yǎng)條件：添加時間為0 d、添加量為0.675%、誘導時間為8.6 h，此條件下的糠醛含量理論值為50.52 μg/mL。根據(jù)給出的最佳培養(yǎng)條件設計試驗進行驗證（設置三組平行試驗）得出發(fā)酵液中糠醛的實際含量分別為50.51、50.47、50.48 μg/mL，與預測值較為接近，說明此模型可以較好地預測誘導條件下的糠醛產量。而在糠醛的最佳誘導條件下發(fā)酵液中5-HMF的實際產量也達到了41.12 μg/mL。

3結論與討論

用誘導子提高微生物次級代謝的產量，不僅與黑曲霉自身的發(fā)酵特性有關，還跟誘導子的種類、誘導子的含量、添加時間和誘導時間有密切的關系。聶麗[28，34]等試驗表明細菌誘導子內的活性成分主要是多糖類物質和蛋白質，并且在誘導鏈霉菌合成農抗702時也是細菌誘導子具有較好的誘導效果。結果顯示，對黑曲霉發(fā)酵作用最好的誘導子為金葡萄球菌代謝產物，是一種細菌代謝產物誘導子，說明細菌代謝產物誘導子對微生物產次生代謝產物具有一定的作用效果，但對于SAE內的具體有效物質還是未知的。在確定最佳誘導子后，觀察誘導子的含量、添加時間和誘導時間對其誘導效果的影響。本試驗在添加濃度為1%時產糠醛量最大，但隨著誘導子的含量增加，出現(xiàn)產糠醛含量較高的添加量。有人將誘導子含量與次生代謝產物的產量的關系概括為飽和型和最適型[35]，最適型可以解釋本試驗的情況。本試驗的最佳添加時間是將種子液與金葡萄球菌代謝產物誘導子一同接入發(fā)酵培養(yǎng)基，即為0 d，表明在對數(shù)生長期末期時加入誘導子，次生代謝產物產量較多。在邊猛[36]試驗中利用Bacillus sp.代謝產物誘導子作用于海洋真菌，結果表明將真菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期末期加入誘導子，產生的次生代謝產物含量最高，這與本試驗的結果一致。關于誘導子最佳添加時間出現(xiàn)的情況，可能是由于在真菌培養(yǎng)早期合成糠醛和5-HMF的關鍵酶前體物質不足，導致早期加入誘導子無法激活關鍵酶的活性，而在對數(shù)生長期末期關鍵酶前體物質充足，受到誘導子的刺激導致關鍵酶活性增強，次生代謝產物含量增多。對于不同的誘導時間，在12～48 h內誘導子具有明顯的促進效應，說明在發(fā)酵初期誘導子的作用效果較明顯。但是隨著誘導子的誘導時間推移，糠醛產量降低，誘導子的作用效果不顯著。而在64 h后出現(xiàn)空白對照的含量高于樣品組，可能是由于前期發(fā)酵大量消耗了培養(yǎng)基中的成分，導致添加誘導子的樣品后期次生代謝產物較空白組少。

響應面優(yōu)化法優(yōu)化發(fā)酵條件具有優(yōu)化速度快，預測結果偏差小等優(yōu)點[37]。目前，已有報道將響應面優(yōu)化法應用于發(fā)酵條件的優(yōu)化以及誘導子篩選等方面。如彭秋菊等[31]用響應面優(yōu)化黑曲霉產糠醛的培養(yǎng)基條件較優(yōu)化前糠醛產量提高了20.2%;魏寶東等[33]利用響應面法優(yōu)化促進納他霉素合成的誘導子誘導條件，經優(yōu)化后納他霉素產量提高了1.68倍。以上試驗說明響應面優(yōu)化法對于發(fā)酵具有較好的優(yōu)化效果。本試驗利用經單因素試驗確定了誘導子的種類、誘導子添加時間、誘導量及誘導時間的范圍后，利用Box-Behnken試驗并結合響應面優(yōu)化篩選出黑曲霉產糠醛最佳條件為：糠醛的添加時間為0 d、添加量0.675%，誘導時間8.6 h。在此條件下培養(yǎng)黑曲霉發(fā)酵液中糠醛含量為50.49 μg/mL，較空白對照（36.84 μg/mL）提高了37%;5-HMF的含量為41.12 μg/mL，較空白對照（32.08 μg/mL）提高了31%。（責任編輯：段麗麗）

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Screening and Optimization of Elicitors for Furfural and 5-Hydroxymethyl Furfural Production by Aspergillus niger

Ding Xuan，Liu Jianrui，Yang Qingqing，Ran Li，Zheng Yaopei，Tian Yu，Wei Yongqin，Liu Weifang，Li Zhu*

（College of Life Sciences，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：In this study，ten biological elicitors and six abiotic elicitors were used to increase the contents of furfural and 5-hydroxymethyl furfural （5-HMF） in the fermentation broth of Aspergillus niger xj.Firstly，elicitors and inducible conditions were screened by single factor，box-Behnken test was designed，and then response surface method was used to optimize the best inducible conditions.The results showed that：the seed liquid of A.niger xj and the elicitor were added into the fermentation medium，0.675% of staphylococcus aureus metabolite elicitor with a reducing sugar concentration of 10 μg/mL was added and induced for 8.6 h.The furfural yield in the fermentation liquid was 50.49 μg/mL，which was 37% higher than that before optimization.Under these conditions，the yield of 5-HMF in fermentation broth was 41.12 μg/mL，an increase of 31%.The results can provide reference for furfural and 5-HMF production by Aspergillus niger fermentation.

Keywords：furfural;5-hydorxymethyl furfural;Aspergillus niger;elicitor;response surface optimization