嗜熱側(cè)孢霉液體發(fā)酵對(duì)玉米秸稈中纖維素降解的影響

任鴻莉，歐陽(yáng)小琪，陳曉健，周馨玥，張琦，夏文靜

（南京師范大學(xué)泰州學(xué)院，江蘇泰州 225300）

中國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量大約是7.8億t，秸稈種類豐富，其中玉米秸稈的產(chǎn)量大約是2.4億t[1]。秸稈是豐富的可再生資源，秸稈還田是當(dāng)今普遍重視的一項(xiàng)培肥土地的措施。秸稈還田不僅可以培肥土地、增加土壤有機(jī)質(zhì)、提高作物產(chǎn)量，還可用來(lái)制作飼料和用作其他副產(chǎn)品生產(chǎn)[2]。秸稈資源化利用中，本身纖維素含量高，自然降解的速度非常緩慢，因此提高降解效率是秸稈利用的核心問(wèn)題。

現(xiàn)有的加快纖維素降解方法有化學(xué)法、物理法和生物法?；瘜W(xué)法以酸化、堿化、有機(jī)溶劑處理和離子液處理為代表[3]。其中酸處理對(duì)容器的要求較高，需要耐腐蝕的容器，預(yù)處理后還需要中和酸，酸處理還會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)品，不利于后續(xù)反應(yīng)。堿處理消耗大，且還需要中和、洗滌、回收等步驟。物理法以蒸汽爆破和高溫高壓處理為主，但設(shè)備投資較大，能耗也很大，不符合經(jīng)濟(jì)環(huán)保的宗旨。生物法具有能耗低、無(wú)污染、降解速率高和成本低等優(yōu)勢(shì)[4-5]。目前降解纖維素的菌有木霉、根霉、青霉和曲霉等[6]。張彥庭和馬一[7]篩選出的菌株1號(hào)（初步鑒定為瑞氏木霉）和菌株2號(hào)（初步鑒定為瑞氏木霉）在30 ℃對(duì)纖維素的降解率達(dá)到16.18%和52.45%。劉最等[8]篩選的菌株1-4（冬克青霉）在28 ℃連續(xù)培養(yǎng)21 d后，纖維素含量由30.00%減少至26.36%。邢慧珍等[9]研究的草酸青霉菌在10 ℃培養(yǎng)15 d對(duì)玉米秸稈的降解率為39.5%。關(guān)于嗜熱側(cè)孢霉的相關(guān)研究較少，嗜熱側(cè)孢霉是對(duì)纖維素有高效降解能力的一類絲狀真菌[10]。該菌具有耐高溫的特點(diǎn)，秸稈在堆肥時(shí)的溫度較高，故該菌對(duì)纖維素降解有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本文主要研究不同發(fā)酵因素對(duì)嗜熱側(cè)孢霉對(duì)玉米秸稈的降解效率的影響，以期為高效利用玉米秸稈提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

嗜熱側(cè)孢霉，由南京師范大學(xué)泰州學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；玉米秸稈，購(gòu)自路路家庭農(nóng)場(chǎng)。

葡萄糖、檸檬酸-檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉、四硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉、乙二醇乙醚、十六烷基三甲基溴化銨、濃硫酸和丙酮，均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA），上海博微生物科技有限公司。

1.2 儀器

FA2004電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；UV1000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司；QWZY-X3組合式搖床，太倉(cāng)市強(qiáng)文實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SX2-5-12馬弗爐，上海雷韻試驗(yàn)儀器制造有限公司；LK-SJH-4S恒溫水浴鍋，上海碩光電子科技有限公司；MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋，日本SANYO公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)，蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；LRH-150F生化培養(yǎng)箱，上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司。

1.3 培養(yǎng)基的配制

液體發(fā)酵培養(yǎng)基配制：葡萄糖1.000 0 g，硫酸鎂0.029 2 g，硫酸銨2.000 0 g，磷酸氫二鉀0.100 0 g，pH值5.0，用蒸餾水定容至1 L；玉米秸稈2.000 0 g/瓶，121 ℃滅菌 20 min。

PDA培養(yǎng)基配制：稱取39 g的馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉，加蒸餾水加熱煮沸溶解，定容到1 L，經(jīng)過(guò)121 ℃滅菌15 min以后備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 纖維素含量的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)對(duì)玉米秸稈中纖維素含量測(cè)定采用范式（VanSoest）分析方法[11]。ADF為酸性洗滌纖維素含量，ADL為酸不溶木質(zhì)素含量，纖維素含量的計(jì)算公式如（1）所示：

將發(fā)酵液在10 000 r/min離心10 min，去上清，收集沉淀；將沉淀用蒸餾水清洗3次，烘干后按照式（1）測(cè)定其纖維素含量。降解率的計(jì)算如式（2）所示：

式中：S1、S2分別為玉米秸稈降解前和降解后的纖維素含量，%。

1.4.2 菌種活化

將嗜熱側(cè)孢霉涂布于PDA固體培養(yǎng)基上，于45 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，之后將菌絲體接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h活化。

1.4.3 秸稈預(yù)處理

將玉米秸稈用剪刀初步剪碎，放在90 ℃烘箱中1 h；取烘干后秸稈，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)100目篩，篩下物即為玉米秸稈粉，放在密封袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 嗜熱側(cè)孢霉對(duì)玉米秸稈降解的條件優(yōu)化

（1）發(fā)酵時(shí)間對(duì)玉米秸稈中纖維素降解率的影響。將嗜熱側(cè)孢霉接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為2%，裝液量為100 mL/250 mL，在40 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)，在第2 d、4 d、6 d和8 d和10 d分別取樣，測(cè)定秸稈中纖維素的含量并計(jì)算降解率，每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣。

（2）發(fā)酵液初始pH值對(duì)玉米秸稈中纖維素降解率的影響。將液體發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)節(jié)到4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，接種量為2%，裝液量為100 mL/250 mL，在40 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)8 d，測(cè)定秸稈中纖維素的含量并計(jì)算降解率，每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣。

（3）接種量對(duì)玉米秸稈中纖維素降解率的影響。將液體發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值調(diào)到6.5，裝液量為100 mL/250 mL，按照1%、2%、3%、4%和5%的接種量進(jìn)行接種，將接種后的培養(yǎng)基在40 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)8 d，測(cè)定秸稈中纖維素的含量并計(jì)算降解率，每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣。

（4）發(fā)酵溫度對(duì)玉米秸稈中纖維素降解率的影響。將液體發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值調(diào)到6.5，裝液量為100 mL/250 mL，接種量為2%，轉(zhuǎn)速為150 r/min，分別在 35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和 60 ℃的條件下培養(yǎng)8 d，測(cè)定秸稈中纖維素的含量并計(jì)算降解率，每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣。

（5）裝液量對(duì)玉米秸稈中纖維素降解率的影響。將液體發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值調(diào)到6.5，接種量為2%，轉(zhuǎn)速為150 r/min，250 mL的三角瓶中分別裝入50 mL、100 mL、150 mL和200 mL培養(yǎng)基，在45 ℃的條件下培養(yǎng)8 d，測(cè)定秸稈中纖維素的含量并計(jì)算降解率，每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣。

（6）轉(zhuǎn)速對(duì)玉米秸稈中纖維素降解率的影響。將液體發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值調(diào)到6.5，裝液量為150 mL/250 mL，接種量為2%，將培養(yǎng)箱的轉(zhuǎn)速分別調(diào)到 100 r/min、125 r/min、150 r/min、175 r/min、200 r/min和225 r/min進(jìn)行培養(yǎng)，在8 d測(cè)定秸稈中纖維素的含量并計(jì)算降解率，每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），利用最小顯著性差異法（Least—Significant Difference，LSD）法進(jìn)行不同處理之間的多重比較，P＜0.05為差異顯著，再用Origin 8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)玉米秸稈中纖維素降解率的影響

由圖1可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，玉米秸稈的降解率在逐漸升高，在第8 d時(shí)降解率達(dá)到了23.58%，第10 d時(shí)降解率為23.28%，兩者無(wú)顯著性差異，因此確定最佳的培養(yǎng)時(shí)間為8 d。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)玉米秸稈中纖維素降解率的影響

2.2 發(fā)酵液初始pH值對(duì)玉米秸稈中纖維素降解率的影響

由圖2可知，隨著pH值的升高,降解率呈上升的趨勢(shì)，當(dāng)pH值達(dá)到6.5時(shí)降解率為26.51%，但隨后降解率呈下降趨勢(shì)。嗜熱側(cè)孢霉產(chǎn)纖維素酶的最佳pH值為6.5，且該纖維素酶在pH值6.5時(shí)的穩(wěn)定性較好，故選擇pH值6.5作為降解的最佳pH值。

圖2 發(fā)酵液初始pH值對(duì)玉米秸稈中纖維素降解率的影響。

2.3 接種量對(duì)玉米秸稈中纖維素降解率的影響

由圖3可知，在接種量為2%時(shí)降解率達(dá)到了26.51%，當(dāng)接種量超過(guò)2%時(shí)，降解率呈下降趨勢(shì)，原因可能是隨著接種量的增加，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也隨之消耗，且代謝廢物積累也越來(lái)越多，菌體營(yíng)養(yǎng)得不到滿足，生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，進(jìn)而影響到纖維素酶的產(chǎn)量，秸稈中纖維素的降解效果也會(huì)受到影響。因此，選擇最佳接種量為2%。

圖3 接種量對(duì)玉米秸稈中纖維素降解率的影響

2.4 發(fā)酵溫度對(duì)玉米秸稈中纖維素降解率的影響

由圖4可知，在35～45 ℃，玉米秸稈的纖維素降解率隨溫度的升高而不斷升高，在45 ℃時(shí)降解率達(dá)到最高29.47%，但之后降解率隨溫度的升高而呈下降的趨勢(shì)，在60 ℃時(shí)降解率降至3.21%。由此可見(jiàn)溫度對(duì)玉米秸稈的降解率影響較大，這是因?yàn)闇囟葘?duì)酶的活性有較大的影響，溫度過(guò)高會(huì)使酶失去活性進(jìn)而導(dǎo)致降解率的降低。因此，選擇45 ℃為最佳的降解溫度。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)玉米秸稈中纖維素降解率的影響

2.5 裝液量對(duì)玉米秸稈中纖維素降解率的影響

由圖5可知，隨著裝液量的升高秸稈中纖維素的降解率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)裝液量為150 mL、200 mL時(shí)降解率分別為32.36%、31.93%，二者無(wú)顯著性差異，因此從經(jīng)濟(jì)的角度出發(fā)，應(yīng)選擇150 mL的裝液量為最佳。

圖5 裝液量對(duì)玉米秸稈中纖維素降解率的影響

2.6 轉(zhuǎn)速對(duì)玉米秸稈中纖維素降解率的影響

由圖6可知，隨著培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速的提高，秸稈的降解率也逐漸升高，當(dāng)轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)玉米秸稈的降解率最高為35.23%，轉(zhuǎn)速為225 r/min時(shí)降解率為35.07%，兩者無(wú)顯著性差異。這是因?yàn)檗D(zhuǎn)速越高，培養(yǎng)基中的溶解氧越高，菌體生長(zhǎng)較快，產(chǎn)酶量也會(huì)隨之增加，對(duì)秸稈的降解效率越好，因此選擇最佳轉(zhuǎn)速為200 r/min。

圖6 轉(zhuǎn)速對(duì)玉米秸稈中纖維素降解率的影響

除轉(zhuǎn)速外，單因素實(shí)驗(yàn)2.6的條件均是前述各單因素實(shí)驗(yàn)的最佳條件，因此轉(zhuǎn)速為200 r/min的實(shí)驗(yàn)組條件即為最優(yōu)工藝組合，即發(fā)酵時(shí)間8 d、發(fā)酵pH值6.5、接種量2%、發(fā)酵溫度45 ℃、裝液量150 mL、轉(zhuǎn)速200 r/min是玉米秸稈降解的最佳條件，在此條件下玉米秸稈的降解率為35.23%，較優(yōu)化前（2.1）提高了78.11%。

3 結(jié)論

對(duì)于利用微生物來(lái)降解玉米秸稈，現(xiàn)在越來(lái)越受到關(guān)注。郭紅偉等[12]研究了木質(zhì)纖維素酶高產(chǎn)菌株的篩選及其對(duì)玉米秸稈降解效果的影響，降解率為20.00%；孫捷等[13]研究了離子液體輔助纖維素酶降解小麥秸稈，降解率為10.42%。本實(shí)驗(yàn)所研究的嗜熱側(cè)孢霉對(duì)玉米秸稈的降解率達(dá)35.23%。較前人研究的降解率高，說(shuō)明嗜熱側(cè)孢霉對(duì)玉米秸稈的降解效果要好。同時(shí)，由于秸稈中化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，單一的微生物產(chǎn)生水解酶的種類和數(shù)量有限，因此對(duì)秸稈的降解能力也有限，所以利用多種菌種協(xié)同處理秸稈提高降解率也慢慢被大眾所推崇。如王益等[14]就把嗜熱側(cè)孢霉與白腐真菌復(fù)配起來(lái)研究其對(duì)秸稈的降解，降解率達(dá)62.61%。因此，在今后的研究中也應(yīng)采用復(fù)合菌系來(lái)降解秸稈。

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)得出嗜熱側(cè)孢霉降解玉米秸稈的最佳發(fā)酵時(shí)間為8 d，最佳發(fā)酵pH值為6.5，最佳接種量為2%，最佳發(fā)酵溫度為45 ℃，最佳裝液量為150 mL，最佳轉(zhuǎn)速為200 r/min。