基于二聚人工抗原ELISA檢測多殘留β2-受體激動劑

劉淼苗,劉啊敏,陳爾凈,馬 骉,張明洲

(中國計(jì)量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310018)

β2-受體激動劑常作為豬、牛和其他農(nóng)場動物的生長促進(jìn)劑使用,可以促進(jìn)動物生長,提高瘦肉率[1-3]。養(yǎng)殖戶為降低耐藥風(fēng)險(xiǎn),經(jīng)常將多種獸藥混合使用[4],這會導(dǎo)致同一批動物產(chǎn)品中出現(xiàn)多種殘留[5]。這些殘留的藥物影響人體健康,容易出現(xiàn)食物中毒、心血管疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[6]等不良癥狀,包括我國在內(nèi)的許多國家相繼出臺法律法令,明令禁止β2-受體激動劑用于養(yǎng)殖業(yè)[7-8]。因此,建立多殘留同時(shí)檢測的高靈敏方法尤為必要。

近年來,高效液相色譜法[9]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10]、液相色譜-質(zhì)譜法[11]、液體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12]、毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測[13]等分析方法，廣泛應(yīng)用于β2-受體激動劑的檢測。雖然大型儀器具有檢測靈敏度高,結(jié)果準(zhǔn)確,可以檢測復(fù)雜樣品的優(yōu)點(diǎn),但程序耗時(shí)、儀器昂貴、人員培訓(xùn)等因素使其并不適合現(xiàn)場篩查和快速分析[14]。免疫層析法具有簡便快速的優(yōu)點(diǎn),但靈敏度相對較低[15-16]。酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)具有檢測耗時(shí)短,操作步驟少,成本低等優(yōu)點(diǎn),在β2-受體激動劑殘留的快檢中具有廣泛應(yīng)用[17-18]。

β2-受體激動劑分為苯酚型和苯胺型[19],克倫特羅(Clenbuterol,CLE)屬于苯胺型[20];萊克多巴胺(Ractopamine,RAC)是苯酚類[21]。若要同時(shí)檢測豬尿中多種獸藥殘留,須同時(shí)檢測兩種類型。現(xiàn)有檢測手段中,多針對一種類型的β2-受體激動劑制備人工抗原,檢測目標(biāo)局限在特定類型。本實(shí)驗(yàn)將CLE和RAC與載體蛋白經(jīng)重氮化反應(yīng)合成CLE-RAC二聚人工抗原,制備抗CLE-RAC單克隆抗體,達(dá)到一次實(shí)驗(yàn)同時(shí)測定苯酚型和苯胺型兩大類β2-受體激動劑的效果。在此基礎(chǔ)上,優(yōu)化ELISA實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件,更高效的實(shí)現(xiàn)豬尿中9種β2-受體激動劑的同時(shí)檢測。該方法可以為β2-受體激動劑等獸藥多殘留免疫分析提供一種新途徑。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

標(biāo)準(zhǔn)品均購自中檢計(jì)量生物科技有限公司,具體信息見表1。牛血清白蛋白(BSA,純度>99.0%)、人血清白蛋白(HSA,純度>98.0%)、羊抗鼠IgG-HRP購自美國Sigma公司。包被液為50 mmol/L的碳酸鹽緩沖液(pH 9.6),稀釋緩沖液為10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)。稀釋緩沖液中加入0.05%的吐溫20即得洗液,洗液中加入5% BSA即得封閉液。終止液為2 mol/L硫酸。其他常規(guī)化學(xué)試劑購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)信息Table 1 Standard related information

Multiskan FC全自動酶聯(lián)免疫分析儀(美國Thermo公司)用于ELISA檢測。Nanopure超純水儀(美國Thermo公司)供應(yīng)超純水。MLS-3750全自動高壓滅菌鍋(日本Sanyo公司)用于滅菌。MCO-15AC CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)用于細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2 二聚人工抗原的合成

采用蘭尼鎳還原法,以羥基苯甲醛和硝基甲烷為起始物,制備萊克多巴胺氨基衍生物(RAC-NH2)。將RAC-NH2采用重氮化法與載體蛋白偶聯(lián),合成完整的萊克多巴胺抗原[22]。CLE人工抗原合成的方法與RAC人工抗原合成的方法相同[23]。在此基礎(chǔ)上合成二聚人工抗原。用天平稱量50 mg CLE和55.2 mg RAC-NH2,兩者同時(shí)加入至6.2 mL 0.5 mol/L的硫酸溶液中,37 ℃水浴20 min,待其溶解后,4 ℃預(yù)冷。加入115.4 μL 10 mg/mL的亞硝酸鈉溶液,冰上攪拌反應(yīng)3 h。用氨基磺酸銨除去過量的NaNO2,將10 mL HSA溶液滴加到上述反應(yīng)環(huán)境中。用1 mol/L NaOH溶液使反應(yīng)環(huán)境的pH值保持在9.0,攪拌4 h。將反應(yīng)液連續(xù)透析4 d,1 d換液2次。透析液保存于-20 ℃?zhèn)溆?。將合成效果最好的CLE-HSA-RAC作為免疫原免疫小鼠,進(jìn)行單克隆抗體制備工作,CLE-BSA-RAC作為包被抗原,合成方法同上。

1.3 單克隆抗體的制備

選擇3只6～8周齡Balb/C健康雌性小鼠,首免用無菌生理鹽水將免疫原CLE-HSA-RAC稀釋成1 mg/mL,與弗氏完全佐劑等量乳化后對小鼠皮下注射[24],劑量為200 μg/只;之后每兩周免疫一次,1 mg/mL免疫原CLE-HSA-RAC與弗氏不完全佐劑等量乳化,劑量為100 μg/只。第3次加強(qiáng)免疫后開始對小鼠眼靜脈叢采血,檢測血清效價(jià)。直到效價(jià)不繼續(xù)升高時(shí),用CLE-HSA-RAC對小鼠脾臟沖擊免疫。沖擊免疫后3 d,將脾臟細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合。通過亞克隆篩選結(jié)合間接競爭ELISA方法篩選出穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株。將其注射到小鼠體內(nèi),獲得腹水。純化腹水以獲得特異性單克隆抗體。

1.4 單克隆抗體與二聚人工抗原最佳稀釋倍數(shù)確定

采用間接競爭ELISA法確定單克隆抗體和CLE-RAC二聚體人工抗原的最佳稀釋倍數(shù)。包被抗原CLE-BSA-RAC用包被液稀釋成1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000四個(gè)梯度,100 μL/孔加到96微孔板中,4 ℃封閉過夜。單克隆抗體也稀釋成1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000四個(gè)梯度,96微孔板中分別加入100 μL/孔的標(biāo)準(zhǔn)品和單克隆抗體,37 ℃反應(yīng)1 h,洗板3次。加入二抗羊抗鼠IgG,100 μL/孔,37 ℃孵育30 min,加入TMB溶液顯色,室溫15 min。加入100 μL/孔的H2SO4,終止反應(yīng)后檢測OD450值。OD450值約為1.0時(shí),可以確定包被抗原和單克隆抗體的最佳稀釋倍數(shù)。

1.5 靈敏度的檢測

用ELISA法檢測靈敏度。根據(jù)1.4節(jié)測定的最佳稀釋倍數(shù),檢測時(shí)加入CLE和RAC混合的標(biāo)準(zhǔn)品(CLE∶RAC=1∶1),與包被抗原CLE-BSA-RAC競爭結(jié)合單克隆抗體。加入的混合標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度梯度為0.1 ng/mL、0.3 ng/mL、0.9 ng/mL、2.7 ng/mL和8.1 ng/mL。采用Origin 8.0軟件,以結(jié)合率為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。將抑制率為50%的混合物的質(zhì)量濃度值定義為半數(shù)抑制濃度值(IC50)。將抑制率為10%(IC10)的CLE-RAC混合質(zhì)量濃度值定義為最低檢測限。

1.6 基于CLE-RAC特異性分析

在相同的實(shí)驗(yàn)條件下分別檢測待測物CLE,RAC,PEAA,SAL,CLO,CIMB,BRO,TUL, MAP,CIM,MAB,ZIL,BAM,TER,CLEN的IC50值。設(shè)定CLE-RAC單克隆抗體與CLE的交叉反應(yīng)率為100%,抗體的特異性通過將CLE的IC50值與其他β2-受體激動劑的IC50值的比值來確定。

1.7 樣品前處理

豬尿取至離心管中,以7 500 r/min的速度離心6 min。用0.22 μm濾膜過濾上清液,除去少量雜質(zhì)。每個(gè)孔中加入40 μL待測。

1.8 測定基質(zhì)效應(yīng)

根據(jù)1.7節(jié)對空白豬尿樣品進(jìn)行前處理,分別在尿液中添加9種0.3 ng/mL的β2-受體激動劑,重復(fù)檢測5次。參照Wang等[25]計(jì)算方式,基質(zhì)效應(yīng)定義為基質(zhì)因子,計(jì)算5次相同質(zhì)量濃度的供試品溶液與對照品溶液之比的平均值,檢測豬尿中9種藥物的基質(zhì)效應(yīng)。基質(zhì)因子可接受范圍為85%～115%。

1.9 最低檢測限和定量限

選擇空白豬尿樣品20份分別采用本研究建立的間接競爭ELISA方法檢測,空白豬尿樣品檢驗(yàn)平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差定義為方法的最低檢測限(Limit of detection, LOD),空白豬尿樣品檢驗(yàn)平均值加上6倍標(biāo)準(zhǔn)差定義為方法的最低定量限(Limit of quantitation, LOQ)。

1.10 準(zhǔn)確度與精密度

空白豬尿分別添加0.5和1.0 ng/mL的CLE與RAC混合標(biāo)準(zhǔn)樣品(質(zhì)量比=1∶1),采用本研究ELISA方法檢測豬尿中β2-受體激動劑的含量,每組重復(fù)6次,計(jì)算樣品的回收率(%)衡量準(zhǔn)確度。精密度以變異系數(shù)(CV,%)衡量,6塊不同時(shí)間包被的酶標(biāo)板,用同一種質(zhì)量濃度的同一個(gè)樣品進(jìn)行檢測,重復(fù)6次,統(tǒng)計(jì)計(jì)算板間CV值。同一時(shí)間包被的酶標(biāo)板,用同一個(gè)樣品添加不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測,重復(fù)6組,統(tǒng)計(jì)計(jì)算板內(nèi)CV值。

1.11 LC-MS/MS比對

將不同質(zhì)量濃度的CLE、RAC和CLE與RAC等質(zhì)量比混合標(biāo)準(zhǔn)品分別添加至空白豬尿樣品中,用本研究建立的方法和LC-MS/MS分別對樣品進(jìn)行檢測,通過兩種檢測方法的相關(guān)性驗(yàn)證本研究建立方法的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原抗體的表征

制備的CLE-BSA-RAC和CLE-HSA-RAC二聚人工抗原使用紫外-可見光譜掃描鑒定。從圖1可見,CLE、RAC、BSA與HSA的特征吸收峰分別為294、275、278與279 nm處。與BSA偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生的偶聯(lián)物CLE-BSA-RAC分別在279 nm和331 nm處有兩個(gè)特征吸收峰。偶聯(lián)物CLE-HSA-RAC分別在281 nm和332 nm處具有兩個(gè)特征吸收峰。這表明2種偶聯(lián)物特征吸收峰已發(fā)生偏移,由此判斷CLE、RAC-NH2已同時(shí)與載體蛋白成功偶聯(lián)。

圖1 CLE-RAC二聚人工抗原表征圖Figure 1 Antigen characterization of CLE-RAC dimerization artificial antigen

對免疫小鼠產(chǎn)生的血清進(jìn)行效價(jià)檢測,如圖2(a)所示。CLE-RAC-2小鼠效價(jià)最高,因此選取2號小鼠制備單克隆抗體。經(jīng)過三輪亞克隆實(shí)驗(yàn),篩選得到2D1、3C4和4C6等3個(gè)穩(wěn)定分泌抗CLE-RAC的細(xì)胞系。如圖2(b)所示,靈敏度最好的為細(xì)胞系2D1分泌的單克隆抗體,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 小鼠抗血清效價(jià)和抗體親和力鑒定結(jié)果Figure 2 Results of antiserum titer in mice and antibody affinity identification

2.2 單克隆抗體與二聚人工抗原最佳稀釋倍數(shù)確定

結(jié)果如表2所示,隨著稀釋倍數(shù)的增加,OD450值不斷減小。二聚人工抗原的最適稀釋倍數(shù)為1∶8 000,單克隆抗體的最佳稀釋倍數(shù)為1∶4 000。

表2 抗原包被度與抗體稀釋倍數(shù)Table 2 Antigen coating and antibody dilution factor

2.3 靈敏度的檢測

如圖3所示,CLE、RAC、CLE-RAC的標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式分別為y=-42.973x+44.624(R2=0.992 7),y=-44.224x+45.176(R2=0.984 4),y=-43.388x+45.003(R2=0.985),計(jì)算CLE、RAC單一藥物和CLE與RAC等質(zhì)量比混合藥物的IC50值分別為0.75 ng/mL、0.77 ng/mL和0.77 ng/mL,最低檢測限值分別為0.088 ng/mL、0.097 ng/mL和0.092 ng/mL。

圖3 間接競爭ELISA線性標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 3 Linear standard curve of indirect competitive ELISA

2.4 特異性試驗(yàn)

特異性結(jié)果如表3所示,有9種β2-受體激動劑的交叉反應(yīng)率值大于16.97%,其余幾種均低于0.1%,因此可以看出該方法能同時(shí)檢測9種β2-受體激動劑。單克隆抗體識別抗原表位是對氨基苯乙醇胺結(jié)構(gòu)。

表3 CLE-RAC單克隆抗體與其他β2-興奮劑的交叉反應(yīng)率

在本研究中發(fā)現(xiàn),MAB的交叉反應(yīng)率為97.40%,通過圖4化學(xué)結(jié)構(gòu)式看出,MAB與CLE結(jié)構(gòu)式非常相似,因此交叉反應(yīng)率高。其余有交叉的幾種β2-受體激動劑幾乎都有對氨基苯乙醇胺結(jié)構(gòu),所以也具有特異性。

圖4 β2-受體激動劑化學(xué)結(jié)構(gòu)式Figure 4 Chemical structural formula of β2-agonists

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

在ELISA分析中,樣品前處理一般不需要嚴(yán)格的純化和提取,但是基質(zhì)干擾的存在可能會影響實(shí)驗(yàn)的靈敏度和重復(fù)性。由表4可得,9種β2-受體激動劑的基質(zhì)因子為(87.9%±2.1)～(112.4%±2.3),在基質(zhì)因子接受范圍內(nèi),對結(jié)果影響較小。

表4 9種β2-受體激動劑的基質(zhì)效應(yīng)(n=5)Table 4 Matrix effects of 9 β2-agonists(n=5)

2.6 最低檢測限和定量限

本研究用ELISA法檢測豬尿樣品,測得的LOD值0.300 ng/mL,LOQ值0.513 ng/mL。

2.7 準(zhǔn)確度和精密度

結(jié)果如表5所示,該方法檢測的回收率為78.00%～117.88%。因此,本研究建立方法在檢測實(shí)際樣品時(shí),回收率高,準(zhǔn)確度也高。實(shí)際樣品檢測的板內(nèi)CV小于13.73%,板間CV小于7.69%。結(jié)果表明,該方法用于實(shí)際樣品檢測時(shí)變異系數(shù)較低,檢測結(jié)果較精密。

表5 陰性生豬尿樣加標(biāo)變異系數(shù)與平均回收率

2.8 LC-MS/MS比對

將CLE、RAC單一藥物及CLE與RAC等質(zhì)量比混合物分別添加到空白豬尿樣品中,用LC-MS/MS和ELISA對其檢測,計(jì)算兩種方法的相關(guān)系數(shù)分析其相符性。結(jié)果如圖5所示,以LC-MS/MS檢測值為X軸,ELISA檢測值為Y軸,得到線性回歸方程分別為1)CLE單一藥物:y=0.836 3x+0.183 5(相關(guān)系數(shù)R2=0.961,n=6);2)RAC單一藥物:y=0.864 1x+0.065 3(相關(guān)系數(shù)R2=0.959 3,n=6);3)CLE與RAC等質(zhì)量比混合藥物:y=0.84x+0.072 7(相關(guān)系數(shù)R2=0.966 8,n=6)。在實(shí)際檢測樣品時(shí),針對CLE、RAC單一藥物和CLE與RAC等質(zhì)量比混合藥物,兩種方法檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)分別為0.961、0.959 3和0.966 8,結(jié)果表明本研究建立的ELISA方法和LC-MS/MS方法有較好的相符性。

圖5 間接競爭ELISA與LC-MS/MS比對檢測結(jié)果Figure 5 Indirect competition ELISA and LC-MS/MS comparison test results

2.9 本研究與參考文獻(xiàn)比較

由表6可以看出,本論文建立的基于二聚人工抗原ELISA檢測β2-受體激動劑的方法,能同時(shí)檢測苯酚型和苯胺型兩大類β2-受體激動劑,檢測限為0.092 ng/mL,檢測水平基本可以達(dá)到檢測單個(gè)β2-受體激動劑時(shí)的水平。因此,本方法可以為藥物多殘留檢測提供一個(gè)新思路。

表6 同類檢測方法比較Table 6 Comparison of similar detection methods

3 討 論

β2-受體激動劑濫用,會在動物體內(nèi)蓄積。食用受污染的動物組織會使藥物進(jìn)入人體從而危及健康。因此,對β2-受體激動劑藥物殘留檢測尤為重要。一般來說,動物體內(nèi)殘留的β2-受體激動劑藥物有兩種類型,利用一次實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測兩個(gè)目標(biāo),對保障食品安全具有重要意義。

沈軒昂等人利用CLE單克隆抗體,結(jié)合金納米材料,檢測豬尿中CLE的線性范圍為0.078～40 ng/mL,最低檢測限為0.041 ng/mL[29]。宋清等人制備RAC單克隆抗體,定量分析結(jié)果顯示,肉眼檢測限為0.5 ng/mL,檢測線性范圍為0.05～2 ng/mL[30]。兩種方法均只能檢測單一藥物殘留。近年來,具有廣泛特異性的免疫分析方法越來越多的受到關(guān)注。這類免疫分析方法具有檢測樣品數(shù)量多、分析效率高、成本費(fèi)用低等顯著特點(diǎn)[31]。因此,廣譜特異性免疫識別已成為多種分析物同時(shí)篩選的首選方法。廣譜特異性免疫測定需要針對所有目標(biāo)分析物制備特異性抗體。利用通用半抗原產(chǎn)生廣譜特異性抗體是最常用的方法。如Wang等[19]制備了針對CLE及其類似物的非特異性單克隆抗體,可以檢測CLE及其類似物。這類方法僅針對一種類型的β2-受體激動劑具有特異性[32]。通用半抗原法雖然能在一定程度上提高β2-受體激動劑的單次檢測數(shù)量,但仍不能同時(shí)檢測兩種類型的β2-受體激動劑。

本研究通過重氮化反應(yīng)制備二聚體人工抗原,達(dá)到同時(shí)檢測兩類β2-受體激動劑的效果。結(jié)合間接競爭ELISA法,建立了一種同時(shí)測定苯胺型和苯酚型β2-受體激動劑的廣譜特異性免疫分析方法。

4 結(jié) 論

本文采用蘭尼鎳還原法合成RAC-NH2,通過重氮化反應(yīng)將CLE和RAC-NH2與載體蛋白偶聯(lián),得到二聚人工抗原。在此基礎(chǔ)上,結(jié)合免疫小鼠和雜交瘤細(xì)胞技術(shù)獲得CLE-RAC單克隆抗體,隨后利用棋盤法確定最佳稀釋倍數(shù)。建立的方法可以快速、高靈敏度地檢測9種β2-受體激動劑。該方法不僅解決了傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中操作復(fù)雜、檢出限低等問題,還突破了單次實(shí)驗(yàn)檢出兩類β2-受體激動劑的瓶頸。通過與LC-MS/MS方法比較,兩種方法之間的相關(guān)性較高(R2>95%)。結(jié)果表明,本研究建立的基于二聚人工抗原的ELISA檢測方法,具有靈敏度高、穩(wěn)定性高、操作簡單等優(yōu)勢,可用于實(shí)際樣品檢測,同時(shí)為食品安全檢測提供了新思路。