食管鱗癌組織MTA1、TAK1和TRAF6的表達(dá)水平與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

高雪峰 張銳 余旭輝 余力

由于不良飲食和生活習(xí)慣等因素，導(dǎo)致我國(guó)食管癌發(fā)病率逐年升高，根據(jù)2019年國(guó)家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示食管癌發(fā)病率位居惡性腫瘤第六位，而死亡率則位居第五位[1]。我國(guó)食管癌多為食管鱗癌，其早期癥狀不明顯致使許多患者病情延誤，而晚期食管鱗癌由于無(wú)法手術(shù)切除、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等因素導(dǎo)致患者生存質(zhì)量和5年存活率均較低[2]。目前除傳統(tǒng)放、化療外靶向治療和生物免疫治療在食管鱗癌的治療中發(fā)揮重要作用，但患者存活率并無(wú)明顯提高[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子1(metastasis associated protein 1，MTA1)的高表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤血管生成，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲能力，在許多腫瘤中表達(dá)異常增高[4]；轉(zhuǎn)化生子因子激活激酶1(transforming growth factor-activated kinase 1，TAK1)屬于蛋白激酶MAP3Ks家族成員，能夠被多種炎性細(xì)胞因子激活參與NF-κB通路的調(diào)節(jié)，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用[5]；而腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)通過調(diào)控JAK2/STAT3通路和NF-κB通路發(fā)揮促腫瘤的作用[6]。但MTA1、TAK1和TRAF6在食管鱗癌中的表達(dá)水平及意義尚不完全明確，因此本研究通過檢測(cè)三者在食管鱗癌中的表達(dá)水平并分析其與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，旨在為食管鱗癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供相關(guān)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 篩選2016年3月至2018年3月于我院普外科行食管癌切除術(shù)的107例食管鱗癌患者腫瘤組織及癌旁組織(腫瘤組織邊緣>2 cm的組織)，其中男77例，女30例，平均年齡(58.19±8.33)歲；TNM分期Ⅰ/Ⅱ期患者61例，Ⅲ/Ⅳ期患者46例；未合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者58例，合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者49例?；颊呒凹覍倬炇饘?duì)研究知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。

1.2 納排與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均為初診食管鱗癌，術(shù)前未接受放、化療，靶向治療及生物免疫治療；②患者術(shù)中病理及細(xì)胞學(xué)檢查明確診斷為食管鱗癌，診斷依據(jù)《食管癌診療規(guī)范(2018版)》[7]；③患者臨床資料完整，無(wú)丟失或遺漏；④患者未合并其他惡性腫瘤、自身免疫性疾病和精神神經(jīng)疾病等。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者術(shù)前接受過放、化療，靶向治療及生物免疫治療；②患者術(shù)中病理診斷非食管鱗癌或食管良性病變；③患者臨床病理資料缺失或遺漏。

1.3 方法

1.3.1 試劑與耗材:MTA1、TAK1、TRAF6兔抗人單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司，免疫組織化學(xué)法試劑盒及蘇木精染色液、二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DBA)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer salin，PBS)、免疫組化抗原修復(fù)液等均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，復(fù)合光學(xué)顯微鏡購(gòu)自德國(guó)徠卡公司。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MTA1、TAK1、TRAF6表達(dá)情況:MTA1、TAK1、TRAF6抗體均按照1∶100比例進(jìn)行稀釋，患者腫瘤組織及癌旁組織標(biāo)本采用4%多聚甲醛固定，脫水包埋獲取石蠟標(biāo)本，組織切片機(jī)切片后經(jīng)烤片、脫蠟、水化等步驟，滴加抗原修復(fù)液微波15 min 修復(fù)抗原，嚴(yán)格按照試劑盒中說明書所示步驟進(jìn)行操作。參照染色強(qiáng)度記分：無(wú)染色記0分、淺黃色記1分、棕黃色記2分、深棕色記3分。再參照陽(yáng)性細(xì)胞密度打分：高表達(dá)細(xì)胞≤25%記 1分，26%～50% 記2分，>50% 記3分。依據(jù)文獻(xiàn)描述[8-10]將上述兩項(xiàng)評(píng)分相乘獲得結(jié)果，結(jié)果≤3分為陰性表達(dá)，>4分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，Graphpad Prism 7.0軟件制作圖表。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier生存曲線比較患者36個(gè)月生存情況，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤及癌旁組織中MTA1、TAK1、TRAF6表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果顯示MTA1、TAK1、TRAF6在腫瘤組織中陽(yáng)性率為74.77%、79.44%、68.22%，而癌旁組織中陽(yáng)性率為29.91%、24.29%、34.58%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 腫瘤及癌旁組織MTA1、TAK1、TRAF6表達(dá)情況 n=107

2.2 腫瘤組織MTA1、TAK1、TRAF6表達(dá)情況與患者臨床病理特征的關(guān)系 將腫瘤組織MTA1、TAK1、TRAF6表達(dá)與患者臨床病理特征比較，MTA1、TAK1、TRAF6與患者性別、年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)，但與腫瘤臨床分期、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度、是否合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小相關(guān)(P<0.05)。見表2～4。

表2 組織MTA1與患者臨床病理特征的關(guān)系 例

表3 組織TAK1與患者臨床病理特征的關(guān)系 例

2.3 組織MTA1、TAK1、TRAF6表達(dá)情況與患者預(yù)后的關(guān)系 對(duì)患者采用微信、電話、門診復(fù)查等方式進(jìn)行隨訪，隨訪間隔3個(gè)月，隨訪患者死亡或隨訪時(shí)間截至2021年3月，共36個(gè)月。107例食管鱗癌患者存活60例，死亡45例，失訪2例，死亡患者均死于食管鱗癌復(fù)發(fā)、進(jìn)展或相關(guān)并發(fā)癥，未發(fā)現(xiàn)死于其他疾病的案例。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中MTA1、TAK1、TRAF6陽(yáng)性表達(dá)患者3年生存率明顯低于陰性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

表4 組織TRAF6與患者臨床病理特征的關(guān)系 例

圖1 食管鱗癌組織中MTA1、TAK1、TRAF6表達(dá)情況與患者生存率的關(guān)系；A 食管鱗癌組織中MTA1與患者生存率的關(guān)系；B 食管鱗癌組織中TAK1與患者生存率的關(guān)系；C 食管鱗癌組織中TRAF6與患者生存率的關(guān)系

3 討論

食管鱗癌是我國(guó)食管癌最常見的病理學(xué)類型，由于其早期診斷較為困難常導(dǎo)致患者預(yù)后不良的發(fā)生，研究表明我國(guó)食管鱗癌患者5年生存率低于40%[11]。研究表明食管鱗癌是一種多基因、多環(huán)節(jié)、多因素共同作用形成的惡性腫瘤，改善食管鱗癌患者預(yù)后、延長(zhǎng)患者生存時(shí)間、提高患者生活質(zhì)量是目前急需解決的重要問題[12]，故需要尋找與食管癌預(yù)后相關(guān)的分子靶點(diǎn)在食管鱗癌的診斷及治療中具有重大意義。

本研究采用免疫組化法檢測(cè)食管鱗癌組織中MTA1、TAK1、TRAF6表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)三者在腫瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，且MTA1、TAK1、TRAF6陽(yáng)性表達(dá)均與患者腫瘤臨床分期、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度、是否合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小相關(guān)，提示MTA1、TAK1、TRAF6促進(jìn)了食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展，并為腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件。腫瘤組織中MTA1、TAK1、TRAF6陽(yáng)性表達(dá)的患者3年生存率低于陰性表達(dá)患者，提示三者在組織中表達(dá)情況能夠作為反映食管鱗癌患者預(yù)后的相關(guān)指標(biāo)發(fā)揮作用。

MTA1得名于其基因表達(dá)水平能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，其也在肝癌、喉癌、前列腺癌等腫瘤中表達(dá)異常升高，常預(yù)示患者預(yù)后不良的發(fā)生。王海清等[13]研究表明MTA1在子宮頸鱗癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織和上皮內(nèi)病變組織，且與腫瘤浸潤(rùn)深度和腫瘤分期相關(guān)，MTA1高表達(dá)的宮頸癌患者常伴隨預(yù)后不佳。研究發(fā)現(xiàn)MTA1能夠通過Wnt通路和Akt通路調(diào)控腫瘤的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤微血管形成，還能夠通過調(diào)控CDK8水平加速腫瘤細(xì)胞周期的運(yùn)行，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[14]，與本研究結(jié)果一致。TAK1是MAP3K家族成員之一，能夠被炎性因子激活參與腫瘤生長(zhǎng)的調(diào)控，TAK1能夠激活NF-kB通路和MAPK通路介導(dǎo)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[15]。研究發(fā)現(xiàn)食管癌患者組織中TAK1及其下游蛋白TAB1水平異常升高，且高表達(dá)患者5年生存率明顯降低[16]。TAK1與TAB家族蛋白結(jié)合后能夠抑制細(xì)胞凋亡的作用，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)行，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，特異性敲低TAK1表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)腫瘤凋亡增加，且腫瘤細(xì)胞發(fā)生G1/S期阻滯[17]，提示TAK1可能成為腫瘤治療的心靶點(diǎn)發(fā)揮作用。TRAF6/TAK1通路在機(jī)體免疫過程中發(fā)揮重要作用，通過激活NF-kB和MAPK通路介導(dǎo)白介素6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎性因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[18]。TRAF6還能夠促進(jìn)AKT蛋白磷酸化和調(diào)控致癌基因Ras的表達(dá)促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，Ras作為TRAF6的下游靶點(diǎn)增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力和生長(zhǎng)能力，體外實(shí)驗(yàn)敲除TRAF6后能夠阻止腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[19]，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明完全抑制TRAF6的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致胸腺萎縮和石骨癥的發(fā)生[20]，骨抑制TRAF6治療腫瘤疾病仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，食管鱗癌組織中MTA1、TAK1、TRAF6陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，且三者表達(dá)情況與患者臨床病理特征和預(yù)后相關(guān)，可能作為食管鱗癌治療及預(yù)后評(píng)估的相關(guān)靶點(diǎn)發(fā)揮臨床作用。