不同培養(yǎng)條件對林可鏈霉菌種子液代謝影響

白茹玉，石彥鵬，張 萍

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川 750100)

林可霉素(Lincomycin)又稱潔霉素，林可霉素屬于林可糖胺類抗生素，最初于1962年由美國普強公司的D.J.manson等從美國尼布拉斯加州林肯市附近地區(qū)的土壤中分離得到的鏈霉菌屬林可鏈霉菌林肯變種(StreptomycesLincolnensisvar.lincolnensis)發(fā)酵所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[1]。林可霉素由4-丙基脯氨酸(PPL) 和ɑ-甲硫基林可酰胺(MTL) 通過縮合反應(yīng)生成去甲基林可霉素，進一步甲基化而生成。主要用于冶療革蘭氏陽性菌引起的感染性疾病[2]。在獸藥方面，林可霉素作為豬場的常用藥物，主要用于革蘭氏陽性菌(鏈球菌，葡萄球菌)，對部分革蘭氏陰性菌也有效果(預(yù)防大腸桿菌，密螺旋體，霉形體)[3]，如霉形體引起的家禽慢性呼吸道病、豬喘氣病、厭氧病等，也用于治療豬密螺旋體痢疾、弓形體病和狗、貓的放線菌病。林可霉素生物合成及代謝調(diào)節(jié)機制是極為復(fù)雜交錯的生理生化現(xiàn)象[4]，目前許多企業(yè)進行工業(yè)化生產(chǎn)林可霉素，都是以好氧發(fā)酵為主進行提取[5]。目前國內(nèi)對于林可霉素的工藝改良多數(shù)通常選用紫外線，快中子等物理誘變手段和硫酸二乙酯(DMS)、甲基磺酸乙酯(EMS)和亞硝酸鹽等化學(xué)誘變手段[6]，或者通過對發(fā)酵搖瓶進行分批補料，提高菌種生產(chǎn)能力，但是通過誘變手段通常會有突變率高，須大量處理材料的缺點，分批補料可能會增加成本。在林可霉素的發(fā)酵過程中，種子液的質(zhì)量對于后續(xù)發(fā)酵能力高低有至關(guān)重要的作用，種瓶經(jīng)過搖瓶培養(yǎng)后，種子液檢測出高的菌濃和狀態(tài)優(yōu)良的菌絲活力，再轉(zhuǎn)接發(fā)酵瓶，以此來提高林可霉素發(fā)酵效價。本文通過實驗探究林可霉素種子液最佳的培養(yǎng)條件進行工藝改良，以達到提高林可霉素發(fā)酵能力，降低林可霉素生產(chǎn)成本的目的，這對林可霉素在豬病治療方面也將具有極其重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種 原始菌種為凍干管粉末，菌種號CGMCC4.1024，由中科院普通微生物菌種保藏管理中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 分離/斜面培養(yǎng)基：可溶性淀粉，黃豆餅粉，KNO3，NaCl，MgSO4·7H2O，K2HPO4。種瓶培養(yǎng)基：玉米淀粉，黃豆餅粉，葡萄糖，(NH4)2SO4，CaCO3。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉，黃豆餅粉，葡萄糖，玉米漿，(NH4)2SO4，NaNO3，KCl，CaCO3。

1.1.3 設(shè)備 BSA2202S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器；XDW25/96型旋轉(zhuǎn)搖瓶機，樂山長征制藥機械有限公司；LDZH-150L立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；BSC-1500IIA2-X凈化工作臺，濟南鑫貝西生物科技有限公司；TDL-5-A臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器；PHS-3C酸度計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；CX31顯微鏡，奧林巴斯；LC-20AT型高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 林可鏈霉菌斜面的制備 取林可鏈霉菌原始菌種CGMCC4.1024，加入1 mL無菌水制備成菌懸液，滴加100 μL菌懸液至斜面培養(yǎng)基上，用滅菌玻璃棒劃線接種，將斜面置于26 ℃培養(yǎng)間培養(yǎng)7 d，待用。

1.2.2 林可霉素種瓶培養(yǎng)溫度驗證 取培養(yǎng)好的林可鏈霉菌斜面挖塊，接種量約1 cm2，接入種瓶培養(yǎng)基后搖勻，將種瓶分別置于26、30、34 ℃的培養(yǎng)間進行發(fā)酵培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置為220 r/min，培養(yǎng)時間為48 h，待培養(yǎng)結(jié)束后，對種瓶的各項指標進行比較，確定最佳培養(yǎng)溫度。

1.2.3 林可霉素種瓶轉(zhuǎn)速驗證 取培養(yǎng)好的林可鏈霉菌斜面挖塊，接種量約1 cm2，接入種瓶培養(yǎng)基后搖勻，將搖瓶機轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為190、220、250 r/min，放置種瓶，進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)間溫度設(shè)置為30 ℃，培養(yǎng)時間為48 h，待培養(yǎng)結(jié)束后，對種瓶的各項指標進行比較，確定最佳搖瓶轉(zhuǎn)速。

1.2.4 林可霉素種瓶培養(yǎng)時間驗證 取培養(yǎng)好的林可鏈霉菌斜面挖塊，接種量約1 cm2，接入種瓶培養(yǎng)基后搖勻，進行搖瓶培養(yǎng)，種瓶搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置為220 r/min，培養(yǎng)溫度設(shè)置為30 ℃，種瓶培養(yǎng)時間分別按45、48、51 h發(fā)酵培養(yǎng)，待培養(yǎng)結(jié)束后，對種瓶的各項指標進行比較，確定最佳培養(yǎng)時間。

1.2.5 設(shè)計正交實驗 正交實驗依據(jù) Galois理論從全面試驗中挑選出部分具有代表性的水平組合進行實驗，通過挑選部分有代表性的水平組合進行實驗并對結(jié)果進行分析找出最優(yōu)的水平組合，以培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度和搖床轉(zhuǎn)速作為因素，設(shè)計三因素三水平實驗，利用SPSS軟件設(shè)計正交表，須進行9種組合的實驗，根據(jù)每種組合培養(yǎng)條件將斜面挖塊，接入種瓶，待培養(yǎng)結(jié)束后轉(zhuǎn)入發(fā)酵瓶，發(fā)酵瓶培養(yǎng)溫度設(shè)置為30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置為220 r/min，搖瓶培養(yǎng)7 d，待發(fā)酵瓶培養(yǎng)結(jié)束后分析實驗結(jié)果。正交實驗因素水平表和設(shè)計表見表1和表2。利用正交表中的方案設(shè)計進行搖瓶種子液培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，檢測結(jié)果。

表1 因素水平表

表2 L9(3)3正交實驗設(shè)計表

1.2.6 各指標檢測方法 種子液pH值的檢測，用已校準過的酸度計進行測定；菌體濃度檢測，先稱量10 mL空離心管重量M1，吸取10 mL菌液后，稱量離心管和菌液的總質(zhì)量M2，然后以3000 r/min離心10 min，倒掉上清，稱量菌體與離心管總質(zhì)量M3，根據(jù)M3-M1/M2求得種子液菌濃；菌絲形態(tài)：滴加一滴菌液于載玻片，自然晾干，用美蘭染色3 min，洗去染色液，晾干，滴加香柏油，用顯微鏡在100倍高倍顯微鏡下觀察菌絲狀態(tài)；氨氮：甲醛測定法[7]；還原糖：斐林氏滴定法[8]；發(fā)酵效價：利用高效液相色譜法[9]檢測發(fā)酵液效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)溫度對種瓶菌絲生長的影響 如圖1所示，當(dāng)溫度為26 ℃時，pH和菌濃均是最低，菌種生長緩慢，菌絲較年輕；還原糖和氨基氮的消耗量較低；當(dāng)溫度為34 ℃時，pH較高，菌濃與28 ℃相比，變化不大，營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，菌絲已衰老，而當(dāng)溫度為30 ℃時，pH處于中間值，菌濃最高，菌絲活力較高，還原糖和氨基氮的利用率高，所以根據(jù)以上分析，確定搖瓶種子液的最適培養(yǎng)溫度為30 ℃。不同溫度下種瓶菌絲生長鏡檢情況如圖2所示，具體描述如下：26 ℃培養(yǎng)，菌絲著色較藍，較分散，較細長，菌液紅褐色，掛瓶度一般；30 ℃培養(yǎng)，菌絲著色很深，較粗長，菌絲抱團，菌液黃綠色，掛瓶度高，粘稠；34 ℃培養(yǎng)，菌絲呈網(wǎng)狀，中空，模糊，菌絲偏老，菌液紅褐色，掛瓶度一般。由菌絲形態(tài)得出，30 ℃較為適合。

菌濃：% 還原糖：g/100 mL 氨基氮：mg/100 mL

圖2 不同培養(yǎng)溫度下菌絲顯微照片(菌絲用美蘭染色，顯微鏡放大倍數(shù)為100倍)

2.2 搖瓶轉(zhuǎn)速對種瓶菌絲生長的影響 如圖3所示，不同轉(zhuǎn)速pH值較為接近，220 r/min菌濃最高。當(dāng)轉(zhuǎn)速過高時，耗氧加快，待培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)現(xiàn)菌絲生長緩慢，菌絲較衰老；而當(dāng)轉(zhuǎn)速較慢時，通氧量減少，不利于菌種生長，當(dāng)轉(zhuǎn)速為220 r/min時，菌絲生長狀態(tài)優(yōu)良，所以根據(jù)以上分析，確定搖瓶種子液的最適搖瓶轉(zhuǎn)速為220 r/min。不同搖瓶轉(zhuǎn)速下種瓶菌絲生長鏡檢情況如圖4所示，具體描述如下：當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速190 r/min時，菌絲較細長，著色較藍，菌絲較分散，菌液掛瓶度一般，紅褐色，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min時，菌絲粗壯，抱團著色很深，菌液掛瓶度高，粘稠，黃綠色。當(dāng)轉(zhuǎn)速為250 r/min時，菌絲著色較深，網(wǎng)狀中空，較為散亂、細長，掛瓶度較為適中。由菌絲形態(tài)得出，220 r/min較為適合。

菌濃：% 還原糖：g/100 mL 氨基氮：mg/100 mL

圖4 不同搖床轉(zhuǎn)速下菌絲顯微照片(菌絲用美蘭染色，顯微鏡放大倍數(shù)為100倍)

2.3 培養(yǎng)時間對種瓶菌絲生長的影響 如圖5可知，隨培養(yǎng)時間延長，pH逐漸升高，但升高幅度較小，51 h菌濃最高，48 h還原糖和氨基氮的利用率最佳。不同培養(yǎng)時間下種瓶菌絲生長鏡檢情況如圖6所示，具體描述如下：當(dāng)培養(yǎng)時間為45 h，菌絲較細長，著色較藍，菌絲部分成團，部分較松散，菌液掛瓶度一般，紅褐色，當(dāng)培養(yǎng)時間為48 h，菌絲粗壯，抱團，密集纏繞，著色很深，菌液掛瓶度高，粘稠，黃綠色。當(dāng)培養(yǎng)時間為51 h，菌絲著色較深，菌絲散亂排列，稍有斷裂，掛瓶度適中，所以48 h菌絲形態(tài)最佳，48 h較為適合。

菌濃：% 還原糖：g/100 mL 氨基氮：mg/100 mL

圖6 不同培養(yǎng)時間下菌絲顯微照片(菌絲用美蘭染色，顯微鏡放大倍數(shù)為100倍)

2.4 發(fā)酵效價對種瓶培養(yǎng)條件影響 如表3所示，根據(jù)正交實驗極差結(jié)果，對林可霉素發(fā)酵效價影響程度按高到低排列分別為C>A>B，根據(jù)正交實驗方差結(jié)果，種瓶最佳組合為A2B2C1，對應(yīng)表3中第7組。

表3 正交實驗發(fā)酵效價結(jié)果記錄

3 結(jié) 論

由種瓶pH、菌濃、菌絲形態(tài)、還原糖和氨基氮利用率、發(fā)酵效價五個方面對種瓶代謝影響進行分析。從圖1分析出不同培養(yǎng)溫度，對每個指標的影響均比較大，這是因為溫度較低時，菌體生長緩慢，待培養(yǎng)結(jié)束后，明顯看到菌液外觀顏色較淺，溫度較高時，種子液代謝加快，營養(yǎng)成分消耗過快，菌體衰老，影響后期發(fā)酵生產(chǎn)能力，所以當(dāng)培養(yǎng)溫度為30 ℃時，各項指標均能達到較為合適的狀態(tài)。從圖2和圖3分析出不同轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時間對林可霉素種子液還原糖和氨基氮的影響較大，這是因為轉(zhuǎn)速對林可霉素溶氧有較大的影響，林可霉素是好氧發(fā)酵，轉(zhuǎn)速的適當(dāng)提高可以加大通氣量，提高溶氧溶度，但轉(zhuǎn)速過高會加快代謝速率，加速菌體衰老，轉(zhuǎn)速過慢，會導(dǎo)致供氧不足，影響種子液生長速率。種子液培養(yǎng)時間不足，菌絲偏年輕，培養(yǎng)時間較長，菌體生長較老，轉(zhuǎn)入發(fā)酵后，均會影響中后期發(fā)酵水平，所以當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min時，培養(yǎng)時間為48 h時，菌絲達到最佳狀態(tài)。pH是一個重要的參數(shù),因為它對細胞生長速率、活性以及產(chǎn)物合成有著顯著的作用。對林可鏈霉菌谷氨酞胺合成酶有影響。實驗證明弱堿性的pH有利于林可霉素的生物合成[10]，所以由表4種子液pH，再結(jié)合菌絲形態(tài)分析出，第7組結(jié)果最好，種子液檢測結(jié)果與發(fā)酵效價結(jié)果一致。正交實驗結(jié)果與單因素實驗結(jié)果基本吻合。

表4 正交實驗種瓶菌絲生長結(jié)果記錄

綜合對比單因素實驗和正交實驗，單因素實驗以固定另外兩個因素不變，改變其中一個因素對種子液培養(yǎng)條件進行考察，根據(jù)pH、菌濃、菌絲形態(tài)、還原糖和氨基氮利用率等檢測指標分析出種子液最佳的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)時間48 h，培養(yǎng)溫度30 ℃，搖瓶轉(zhuǎn)速220 r/min。在此培養(yǎng)條件下，菌絲狀態(tài)均達到最佳，菌濃較高，還原糖和氨基氮利用率高。正交實驗以三因素三水平設(shè)計正交表，利用SPSS軟件設(shè)計出9種組合實驗，根據(jù)每組培養(yǎng)條件發(fā)酵培養(yǎng)，通過檢測種瓶pH、菌濃、菌絲形態(tài)、還原糖和氨基氮利用率和發(fā)酵效價，分析出種子液最佳的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)時間45 h，培養(yǎng)溫度30 ℃，搖瓶轉(zhuǎn)速220 r/min。單因素與正交實驗結(jié)果基本吻合，但培養(yǎng)時間有所出入，之所以有所出入，其主要原因在于正交實驗和單因素實驗各自的條件和目的不一樣，單因素實驗只是考慮單一變量對結(jié)果的影響，而正交實驗是在不同的因素水平下，綜合對比，選取出最佳的培養(yǎng)條件，所以種瓶的培養(yǎng)時間有所出入亦是正常，并且在這兩種實驗設(shè)計方案中，得出的培養(yǎng)時間差距較小，說明45～48 h這個范圍內(nèi)，均比較適合種瓶生長，所以確定種瓶培養(yǎng)時間為45～48 h。按照單因素實驗和正交實驗確定的培養(yǎng)條件，將種子液接入小罐，結(jié)果顯示，種子有更強的生命力，發(fā)酵產(chǎn)量更高。