雞蛋及牛奶中四環(huán)素類藥物殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定法

張崇威，李華岑，陳 薔，彭 麗，張振宇，吳志明

(1.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008；2.濟(jì)源市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗中心，河南濟(jì)源，459000)

四環(huán)素類藥物屬于對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌均敏感的人工合成抗生素[1-2]，作用機(jī)理為其與細(xì)菌核蛋白體的30 s亞基團(tuán)結(jié)合，阻止aa-tRNA同核蛋白體結(jié)合，從而阻止肽鏈延伸和細(xì)菌蛋白質(zhì)合成[3]，作為一類廣譜抗生素已被廣泛應(yīng)用于畜禽等養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的疾病治療中。但由于養(yǎng)殖戶的濫用、盲用、不遵守休藥期使用等多種原因，四環(huán)素類藥物及其代謝物易在肝腎中富積并隨乳汁分泌排出而流入食物鏈[4]，并且作為飼料添加劑，造成雞蛋中藥物殘留問題不斷增多，影響牙齒及骨骼發(fā)育、腸道菌群失調(diào)、細(xì)菌耐藥以及環(huán)境污染等諸多問題[5]，因此，國內(nèi)外都對四環(huán)素類藥物殘留實施了嚴(yán)格的監(jiān)控[6]，我國在GB31650-2019中也明確規(guī)定：牛/羊奶中土霉素、金霉素、四環(huán)素單個或組合最大殘留限量為100 μg/kg，雞蛋中土霉素、金霉素、四環(huán)素單個或組合最大殘留限量為400 μg/kg，多西環(huán)素為泌乳期禁用。目前尚無牛奶及雞蛋中同時檢測4種四環(huán)素類化合物殘留檢測的國標(biāo)，且相關(guān)文獻(xiàn)也較少，因此，對建立一種同時適用于牛奶及雞蛋中4種四環(huán)素類藥物殘留檢測方法具有重要意義?，F(xiàn)有相關(guān)國家標(biāo)主要為GB/T 21317-2007 動物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留量檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法與高效液相色譜法、農(nóng)業(yè)部1025號公告-12-2008 雞肉、豬肉中四環(huán)素類藥物殘留檢測-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。前者定量限偏高，已與目前高靈敏度儀器不相符，且適用范圍不包含雞蛋基質(zhì)，后者適用范圍缺少多西環(huán)素物質(zhì)。目前文獻(xiàn)報道的方法主要有微生物法[7-10]、免疫檢測法[11-13]、毛細(xì)管電泳法[14-16]、薄層色譜法[17]、高效液相色譜法[1,3,18-24]、液質(zhì)聯(lián)用法[25-30]，近年由于固相萃取柱(SPE)結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀的普及，以及其高通量、高靈敏度、高效率的特性，越來越成為殘留檢測的主要手段。現(xiàn)有國標(biāo)及文獻(xiàn)報道的四環(huán)素類殘留檢測的提取液均以水相Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液為主，對于含有較細(xì)固體顆粒的樣品，極易造成在前處理過程中SPE小柱凈化濃縮時嚴(yán)重堵柱現(xiàn)象，無法繼續(xù)過柱，造成實驗失敗。部分國標(biāo)或文獻(xiàn)采取部分提取液過柱的方法從而減少堵柱現(xiàn)象，但這大大降低了方法的靈敏度。本研究從優(yōu)化前處理過程：將提取液過快速濾紙，并在HLB小柱內(nèi)添加脫脂棉的方法，可將全部提取液凈化濃縮，從而提高方法靈敏度，為四環(huán)素類殘留的檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 Waters Acquity UPLC - Xevo TQ-S 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)(waters公司)；ES3200型天平(感量0.01 g)(METTLER公司)；S470-K型酸度計(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；3K-30型臺式高速冷凍離心機(jī)(德國sigma公司)；TARGIN TECH VX-03多管渦旋振蕩器(北京踏錦科技有限公司)；TTL-DC II型24位水浴氮吹儀；Milli-Q超純水機(jī)(美國Millipore公司)；KQ 5800 B型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)；IKA MS3 Basic圓周振蕩器(廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司)。

1.2 對照品與試劑 四環(huán)素、土霉素、金霉素、多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量分別為95.0%，97.6%，92.1%，85.2%。乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O)，優(yōu)級純；磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)，分析純；檸檬酸(C6H8O7·H2O)，分析純。Mcllvaine-Na2EDTA緩沖鹽：將37.2 g C6H8O7·H2O，27.6 g Na2HPO4·12H2O，37.2 g Na2EDTA·2H2O溶于1000 mL水中，混勻即得。甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，購自Fluck公司；HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL，用前在管中加入適量脫脂棉)，天津市天興達(dá)科技有限公司；水為一級水。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別精密稱取4種四環(huán)素類藥物各約10 mg，于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1 mg/mL四環(huán)素類藥物的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。準(zhǔn)確吸取0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液至另一10 mL容量瓶中，用30%甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品采集與制備 雞蛋采自超市，牛奶采自奶牛養(yǎng)殖基地。經(jīng)檢測均無四環(huán)素類藥物殘留。將雞蛋蛋清蛋黃均質(zhì)勻漿，同牛奶分別置于50 mL離心管備用。

1.3.3 樣品前處理 提?。喝≡嚵? g(精確至±0.05 g)，于50 mL聚丙烯離心管中，加入Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液10 mL，振蕩10 min，低溫(5 ℃)14000 r/min離心10 min，吸取上層液體于另一50 mL離心管中。重復(fù)用10 mL Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液提取1次，合并提取液并混勻，低溫(5 ℃)14000 r/min離心10 min，取雞蛋試樣上清液備用；奶試樣上清液經(jīng)快速濾紙過濾后備用。凈化：固相萃取柱依次用甲醇、水各3 mL活化，備用液過柱，用水3 mL，5%甲醇(V/V)3 mL淋洗，抽干，甲醇3 mL洗脫，抽干，收集洗脫液于帶刻度的玻璃管中，于45 ℃下氮氣吹至液體小于1 mL，加30%甲醇至1.00 mL，渦旋混勻，溶液濃度超出曲線范圍時需用空白基質(zhì)復(fù)溶液(按該處理方法處理空白樣品至“加30%甲醇至1.00 mL”混勻即得)稀釋至溶液濃度在曲線濃度范圍內(nèi)，過0.22 μm 微孔濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.3.4 儀器條件 色譜參考條件：色譜柱為Waters Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫程序見表1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫條件

質(zhì)譜參考條件：離子源：電噴霧(ESI)離子源；掃描方式：正離子；檢測方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)；電離電壓：3.3 kV；錐孔電壓：25 V；源溫：150 ℃；脫溶劑氣溫度：450 ℃；錐孔氣流速：150 L/h；脫溶劑氣流速：800 L/h；定性、定量離子對、離子源、錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 定性、定量離子及對應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量

1.3.5 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.3.1項)適量，用30%甲醇稀釋成濃度為100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)中間液0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mL于空白基質(zhì)洗脫液液中(空白基質(zhì)洗脫液：按1.3.3項方法處理樣品至“甲醇3 mL洗脫”時所收集的液體即為空白基質(zhì)洗脫液，下同)，并同樣品同步處理后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。按對照溶液濃度及相應(yīng)峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.3.6 方法靈敏度確定 采用空白樣品中添加目標(biāo)化合物的方法，依據(jù)特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N≥3 的濃度為方法檢測限，S/N≥10的濃度為方法定量限，添加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液于2 g空白試樣中，制備得到一定濃度的添加樣品，經(jīng)前處理后檢測，在相應(yīng)的保留時間，空白試樣對所測藥物無干擾，測定靈敏度。

1.3.7 準(zhǔn)確度和精密度的測定 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，分別準(zhǔn)確稱取空白樣品2 g，添加一定體積的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使樣品中各藥物濃度分別為LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL(土霉素、四環(huán)素及金霉素)與LOQ、2LOQ、10LOQ(多西環(huán)素)，按1.3.3項方法處理后進(jìn)行測定，一日內(nèi)每種藥物每個添加濃度取5個平行樣品分別進(jìn)行測定，重復(fù)測定3 d，外標(biāo)法基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，計算回收率和批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確量取濃度為100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mL于空白基質(zhì)洗脫液(1.3.5項)中，N2吹至小于1 mL，加30%甲醇至1.00 mL，充分混勻，過微孔濾膜，作為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測定。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，4種藥物的回歸方程及相關(guān)系數(shù)r見表3，由表3可見，4種藥物在5～100 μg/kg的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均大于0.9990。圖1為空白雞蛋中添加濃度為10 μg/kg的特征離子質(zhì)量色譜圖。

表3 回歸方程相關(guān)系數(shù)

圖1 空白雞蛋中添加10 μg/kg四環(huán)素類藥物特征色譜圖

2.2 方法靈敏度 按1.3.3項所述方法進(jìn)行處理，依據(jù)特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N≥3的濃度為方法檢測限，S/N≥10的濃度為方法定量限，得出四環(huán)素類化合物在雞蛋及牛奶中的檢測限均為2 μg/kg，定量限均為5 μg/kg?？瞻纂u蛋中添加5 μg/kg四環(huán)素類藥物的特征離子質(zhì)量色譜圖見圖2。

圖2 空白雞蛋中添加5 μg/kg四環(huán)素類藥物特征色譜圖

2.3 方法準(zhǔn)確度及精密度 在空白雞蛋及牛奶中添加土霉素、四環(huán)素、金霉素的LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL及多西環(huán)素LOQ、2LOQ、10LOQ等不同濃度的添加量進(jìn)行回收率實驗，結(jié)果匯總見表4、表5，可知，四環(huán)素類藥物在該添加濃度水平范圍內(nèi)，在雞蛋基質(zhì)中回收率范圍為81.5%～110.0%之間，在牛奶基質(zhì)中回收率81.2%～109.8%之間，批內(nèi)批間RSD均小于11.4%。結(jié)果表明本方法定量準(zhǔn)確，重復(fù)性好。

表4 空白雞蛋中添加四環(huán)素類藥物回收率試驗結(jié)果

續(xù)表

表5 空白牛奶中添加四環(huán)素類藥物回收率試驗結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 提取溶劑及添加量的選擇 考慮到四環(huán)素類藥物具有較強(qiáng)的極性，易與金屬離子螯合形成配合物[31]，影響其溶解性，且易與生物樣品中的蛋白質(zhì)形成共軛物，以上兩點造成提取困難，回收率低，同時還需考慮到沉淀蛋白的操作，因此，提取生物樣品時往往需加入金屬絡(luò)合劑和強(qiáng)酸或酸性去蛋白試劑，Mechael[32]等報道了沉淀蛋白的多種處理方式，如溶劑萃取、有機(jī)溶劑與酸性化合物混合提取、1%三氯乙酸等，本研究在考慮這些方法的同時，也考察了乙酸鋅和亞鐵氰化鉀(1∶1)、硫酸銨、低濃度硫酸水溶液等，均不同程度使回收率明顯降低，甚至無法檢測到目標(biāo)物，例如加入硫酸水溶液，而有機(jī)溶劑易造成蛋白變性，提取率低。因此，擬采用含金屬絡(luò)合劑的酸性水相提取液。本方法參考了國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 22990-2008、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1025號公告-12-2008、GB/T 21317-2007)、美國農(nóng)業(yè)部FSIS官方的分析方法以及其他的相關(guān)文獻(xiàn)，提取液采用了Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH 4.0)進(jìn)行提取。依據(jù)GB/T 27404-2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測中附錄F檢測方法確認(rèn)的技術(shù)要求，本研究對已制定最高殘留限量的四環(huán)素、土霉素、金霉素的添加量在LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL水平，對禁用物質(zhì)多西環(huán)素的添加量在LOQ、2LOQ、10LOQ水平，且回收率均滿足該規(guī)范的要求。

3.2 凈化條件選擇 參照國標(biāo)GB/T 21317-2007、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1025號公告-12-2008等，本試驗優(yōu)先選擇規(guī)格為60 mg/3 mL的HLB固相萃取柱，但在試驗過程中出現(xiàn)嚴(yán)重堵柱現(xiàn)象，通過對比Waters HLB與國產(chǎn)HLB固相萃取柱，同時采用低溫高速離心，發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)HLB 柱過柱過程優(yōu)于Waters HLB。在過濾環(huán)節(jié)，本研究比較了定性濾紙與定量濾紙的差別，定量濾紙出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象，而快速定性濾紙過濾效果明顯且過程順利，同時在凈化柱內(nèi)添加脫脂棉后，堵柱現(xiàn)象明顯改善，取得了滿意效果。但雞蛋過濾紙后，在過固相萃取柱時出現(xiàn)了嚴(yán)重堵柱現(xiàn)象，反而未過濾紙的提取液比較容易過萃取柱，考慮為雞蛋式樣中的脂溶性物質(zhì)較多，利于試樣的過柱，故雞蛋采取提取液經(jīng)高速冷凍離心后直接過柱。此操作使得四環(huán)素類藥物在雞蛋及牛奶中回收率范圍在81.2%～110.0%之間，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于11.4%，定量限為5 μg/kg。優(yōu)于E Yoshida[31]等報道 的牛奶基質(zhì)中四環(huán)素類藥物回收率范圍為70%～120%、變異系數(shù)小于25%、定量限為10 μg/kg以及Michael[32]等報道的雞蛋基質(zhì)中四環(huán)素類回收率范圍為45%～55%、定量限為10～50 μg/kg。凈化效果顯著。

3.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化 將適當(dāng)濃度的四環(huán)素類單標(biāo)溶液進(jìn)樣，以正離子模式進(jìn)行一級質(zhì)譜圖掃描，發(fā)現(xiàn)各化合物的[M+H]+峰較強(qiáng)，選擇[M+H]+作為母離子，進(jìn)行子離子掃描，并從中選擇響應(yīng)值較高的兩個子離子分別是定量離子和定性離子。根據(jù)歐盟2002/657/EC要求，要確證該類物質(zhì)至少需要3個識別點(IP)，因此，分別選擇了母離子以及對應(yīng)的兩個響應(yīng)較強(qiáng)的子離子作為定性定量依據(jù)，這樣一個母離子1個IP點，對應(yīng)兩個子離子分別1.5個IP點，滿足3個IP點的要求，符合了歐盟有關(guān)法規(guī)的要求。另外，實驗比較了氮氣吹干后加1.00 mL 30%甲醇復(fù)溶及氮氣吹至小于1.00 mL后加30%甲醇定容至1.00 mL，后者方法回收率明顯提高，考慮原因為四環(huán)素類特別是多西環(huán)素藥物在高熱干燥的環(huán)境下分解速度加快。

4 實際樣品檢測

采用本方法對市場上購買的98批雞蛋及100批牛奶樣品進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示：9批雞蛋樣品檢出土霉素，結(jié)果為5.68～53.2 μg/kg，3份雞蛋檢出金霉素，結(jié)果為8.51～26.5 μg/kg，3批雞蛋檢出多西環(huán)素，結(jié)果為11.6～256 μg/kg。1批牛奶檢出多西環(huán)素，結(jié)果為11.1 μg/kg。說明在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中存在使用該類藥物的現(xiàn)象，此方法可用于雞蛋及牛奶中四環(huán)素類化合物殘留的測定，降低食品安全隱患。

本研究通過優(yōu)化樣品提取凈化分離條件，建立了利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測雞蛋及牛奶中四環(huán)素類藥物殘留量的方法，與國標(biāo)GB/T 21317-2007及農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1025號公告-12-2008方法相比，提高了方法靈敏度，彌補(bǔ)了國標(biāo)方法適用基質(zhì)范圍窄的問題，重現(xiàn)性好，操作簡便，能夠滿足對雞蛋及牛奶中四環(huán)素類藥物殘留分析檢測，為獸藥殘留檢測工作提供技術(shù)支持。