崀山臍橙皮黃酮提取物對酪氨酸酶的抑制活性研究

◎ 周新崇，易 燦，劉進(jìn)兵

（邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽 422000）

酪氨酸酶（EC 1.14.18.1，tyrosinase）是黑色素合成和果蔬褐變的關(guān)鍵酶，在植物中使果蔬發(fā)生酶促褐變，在人體內(nèi)代謝異常則會引起部分色素沉著性皮膚病，還與人類的黑色素瘤和白化病等疾病有直接關(guān)聯(lián)[1-2]?；瘜W(xué)合成的酪氨酸酶抑制劑具有一定毒副作用，因此從植物源中尋找酪氨酸酶抑制劑受到研究者關(guān)注。

邵陽市新寧縣崀山片區(qū)產(chǎn)的崀山臍橙，地處贛南-湘南-桂北臍橙產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢帶，自20世紀(jì)70年代大力推廣種植臍橙以來，已經(jīng)成為全國較大的臍橙生產(chǎn)區(qū)[3]。臍橙皮中含有豐富的黃酮類物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎癥、降血壓等活性[4]。本文擬通過酶抑制動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)、熒光光譜技術(shù)，研究崀山臍橙皮提取物的石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物對酪氨酸酶的抑制活性及其抑制機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

崀山臍橙皮粉（采摘自湖南省邵陽市新寧縣白沙鎮(zhèn)白沙園藝場的12月成熟期的崀山臍橙果，取其果皮在60 ℃恒溫干燥至恒重，粉碎過60目篩）；蘑菇酪氨酸酶（美國Sigma公司）；左旋多巴胺（L-DOPA，純度≥99%，Johnson Matthey化學(xué)公司）；曲酸（純度≥97%，上海阿拉丁生化科技有限股份公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

101-1AB烘箱（天津市泰斯儀器有限公司）；SF-130型高速中藥粉碎機(jī)（中南制藥機(jī)械廠）；ME203E型分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；MCR-3常壓微波化學(xué)反應(yīng)器、SHB-ⅢA循環(huán)水式真空泵（鞏義市中天儀器科技有限公司）；IKA HB10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA公司）；PT-3502C全波長酶標(biāo)分析儀（北京普天新橋技術(shù)有限公司）；Cary Edipse熒光光譜儀（美國安捷倫科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 崀山臍橙皮黃酮的提取與萃取

稱取崀山臍橙皮粉20 g，放入三口燒瓶中，在料液比為1∶40（g∶mL）、乙醇濃度為75%、微波功率為480 W、提取溫度60 ℃的條件下，分3次提取4 min，每次間隔10 min，將提取物抽濾，用75%乙醇溶液洗滌濾餅3次，濾液減壓濃縮至浸膏[5-6]。

所得浸膏用溫水200 mL制成混懸液，依次分別用石油醚400 mL、乙酸乙酯400 mL、正丁醇300 mL萃取，每次添加100 mL有機(jī)溶液萃取，直到有機(jī)層接近無色，分別合并不同上層有機(jī)溶劑萃取液，并收集下層水相，四相分別減壓濃縮干燥，稱重后所得浸膏分別用75%乙醇溶液定容到50 mL容量瓶中，得到崀山臍橙皮石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水的四相萃取物，待用[7-10]。

1.3.2 對酪氨酸酶活性抑制效果分析

本文參照文獻(xiàn)略作修改[10-12]。從崀山臍橙皮石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相各母液中，用移液槍精確配制成初始質(zhì)量濃度1 000 mg·mL-1的溶液，試驗(yàn)時(shí)配制成濃度依次為 62.5 mg·L-1、125.0 mg·L-1、250.0 mg·L-1、500.0 mg·L-1和 1 000.0 mg·L-1的不同極性部位溶液和曲酸對照液[10]。

在總體積為220 μL，磷酸鹽溶液（pH 6.8，0.5 mol·L-1）為緩沖液的體系中，96孔板中依次加入150 μL磷酸鹽緩沖液、20 μL待測樣品（其中空白組20 μL磷酸鹽緩沖液），10 μL酪氨酸酶溶液（0.05 mg·mL-1），在37 ℃下氣浴恒溫孵化15 min后，加入 20 μL L-DOPA 溶液（10 mmol·L-1），使用酶標(biāo)儀測量在475 nm下的溶液吸光值，曲酸進(jìn)行同樣處理。酪氨酸酶抑制率按式（1）計(jì)算：

式中：B為空白吸光度；S為樣品吸光度。

1.3.3 對酪氨酸酶的抑制動(dòng)力學(xué)分析

試驗(yàn)參照的方法略微修改，在與1.3.2相同的試驗(yàn)條件下，分別加入不同濃度的樣品溶液，固定酪氨酸酶的濃度為0.05 mg·mL-1，測定反應(yīng)體系中ΔOD隨底物L(fēng)-DOPA濃度增加的變化趨勢，以底物質(zhì)量濃度的倒數(shù)為x軸和反應(yīng)速率的倒數(shù)為y軸繪制Lineweaver-Burk曲線，根據(jù)直線交點(diǎn)的位置判斷崀山臍橙皮取物對酪氨酸酶的抑制類型[13]。

1.3.4 熒光淬滅試驗(yàn)

崀山臍橙皮提取物對酪氨酸酶的熒光淬滅試驗(yàn)參照的方法略微修改[10,14-15]。熒光光譜的試驗(yàn)條件設(shè)置為激發(fā)波長280 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為5 nm，掃描的速度為中速，掃描電壓為高壓800 V。加入2 mL的0.01 mg·mL-1的酪氨酸酶溶液，測定其熒光光譜后，再逐次加入200 mg·L-1的崀山臍橙皮正丁醇相溶液，每次100 μL，混合均勻后靜置2 min，分別在25 ℃、31 ℃和37 ℃溫度下掃描各樣品在290～500 nm處的發(fā)射光譜，判斷其熒光猝滅類型。

2 結(jié)果與分析

2.1 崀山臍橙皮提取物對酪氨酸酶活性的抑制效果

以曲酸為對照物，崀山臍橙皮不同萃取層對酪氨酸酶活性的抑制作用如圖1所示。崀山臍橙皮四相萃取物對酪氨酸酶活性的抑制效果隨質(zhì)量濃度增大而增強(qiáng)，并呈量效關(guān)系，抑制能力大小為正丁醇相＞乙酸乙酯相＞石油醚相＞水相，由SPSS軟件分析得石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相和曲酸抑制酪氨酸酶活性的IC50值分別為469.141 mg·L-1，409.298 mg·L-1，358.150 mg·L-1，475.724 mg·L-1和113.555 mg·L-1。

圖1 曲酸和崀山臍橙皮各萃取層對酪氨酸酶的抑制率圖

2.2 崀山臍橙皮提取物對酪氨酸酶抑制動(dòng)力學(xué)分析

由2.1可知，崀山臍橙皮正丁醇相對酪氨酸酶抑制效果最好，所以選擇此相進(jìn)行抑制動(dòng)力學(xué)分析。由圖2可知，隨著崀山臍橙皮正丁醇相的質(zhì)量濃度增大，直線斜率增大，且直線幾乎相交于橫軸的一點(diǎn)，米氏常數(shù)Km基本不變，最大反應(yīng)速率Vmax減小，由此推斷崀山臍橙皮正丁醇相對酪氨酸酶的抑制作用類型為非競爭抑制[10]。根據(jù)Lineweaver-Burk方程（表1）計(jì)算得正丁醇相的Km值約17.448 mmol·L-1。以各直線與縱坐標(biāo)的交點(diǎn)對崀山臍橙皮正丁醇相質(zhì)量濃度進(jìn)行二次作圖得到圖3，通過這條直線與橫軸的交點(diǎn)可求得崀山臍橙皮正丁醇相對酪氨酸酶的抑制常數(shù)KI為398.68 mg·L-1。

圖2 崀山臍橙皮正丁醇相對酪氨酸酶抑制類型圖

圖3 崀山臍橙皮正丁醇相對酪氨酸酶抑制作用Lineweaver-Burk圖

表1 崀山臍橙皮正丁醇相對酪氨酸酶抑制作用的Lineweaver-Burk方程表

2.3 崀山臍橙皮正丁醇相提取物對酪氨酸酶的熒光淬滅作用

當(dāng)溫度25 ℃時(shí)，不同濃度崀山臍橙皮正丁醇相溶液對酪氨酸酶的熒光發(fā)射光譜如圖4所示。隨著崀山臍橙皮正丁醇相濃度（a ～ e 為 0 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1和 40 mg·L-1）增加，酪氨酸酶的熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度不斷降低，說明產(chǎn)生熒光猝滅[14]。

2.4 崀山臍橙皮正丁醇相提取物對酪氨酸酶的熒光猝滅機(jī)理

根據(jù)Stern-Volmer方程進(jìn)一步分析崀山臍橙皮正丁醇相對酪氨酸酶的熒光猝滅機(jī)制[15]，通過F0/F對[Q]作圖，見圖5，得出25 ℃、31 ℃、37 ℃下的猝滅常數(shù)Ksv（表2），雖然隨著溫度升高，Ksv值增大，但Kq大于2×1010L·mg-1·s-1（最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)），表明崀山臍橙皮正丁醇相對酪氨酸酶的熒光猝滅機(jī)制屬于靜態(tài)型[13]。

圖5 崀山臍橙皮正丁醇相對酪氨酸酶熒光猝滅的Stern-Volmer圖

表2 崀山臍橙皮正丁醇相提取物與酪氨酸酶相互作用的Stern-Volmer方程表

3 結(jié)論

本文采用微波輔助法提取崀山臍橙皮有效成分，并依次分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取，測試了不同相萃取物體外抑制酪氨酸酶活性，優(yōu)選活性較好的正丁醇相進(jìn)行酶抑制動(dòng)力學(xué)評價(jià)、熒光光譜分析。結(jié)果表明，崀山臍橙皮正丁醇相以非競爭抑制的形式與酪氨酸酶相互作用；熒光光譜分析表明，崀山臍橙皮正丁醇相對酪氨酸酶是靜態(tài)型猝滅，酶濃度增大，猝滅作用增強(qiáng)。本文的研究成果為崀山臍橙皮的綜合利用提供了參考，以更好地服務(wù)鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略。