水產(chǎn)品中甲基睪酮殘留檢測方法研究進展

◎ 鄭 蓉，張 娟，姜美勤

（鈦和檢測認證集團股份有限公司，上海 200060）

食品安全與人們的身體健康密切相關(guān)。但是，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，為了防治各種疾病、縮短養(yǎng)殖周期、追求產(chǎn)量，存在不合理用藥、違禁使用藥物的問題，造成水產(chǎn)品中抗生素殘留超標，還出現(xiàn)了為防治水霉病而使用孔雀石綠的事件以及“3·15”曝光的海參除草劑事件等，因此中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部對我國的食品安全問題也日益重視。

人工合成的類固醇藥物甲基睪酮（Methyltestosterone，MT），呈白色或乳白色結(jié)晶性粉末，具有雄性和蛋白同化雙重作用。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，苗種培育和性別控制的特效藥物之一——甲基睪酮，受到養(yǎng)殖戶的青睞[1]。但攝入含有甲基睪酮殘留的水產(chǎn)品會對人體健康產(chǎn)生危害，可能會造成人體激素水平失衡，肝中毒、胎體中毒等。我國國家標準中已明確規(guī)定，禁止使用甲基睪酮等激素類藥物作為動物培育的“性誘導劑”，在水產(chǎn)品中不得檢出甲基睪酮，因此對水產(chǎn)品中甲基睪酮殘留檢測方法的研究在食品安全行業(yè)中必不可少。本文概述了甲基睪酮的作用機制、危害和相關(guān)法規(guī)標準，針對水產(chǎn)品中甲基睪酮的前處理方法和檢測技術(shù)進行了系統(tǒng)綜述，并分析了未來需要解決的技術(shù)挑戰(zhàn)，對今后的研究進行了展望，旨在為水產(chǎn)品中甲基睪酮殘留檢測和監(jiān)管提供技術(shù)提供參考。

1 甲基睪酮概述

1.1 甲基睪酮的機理

甲基睪酮又叫甲基睪丸素和甲睪酮，是一種蛋白同化雄性激素。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，甲基睪酮曾一度被用于苗種培育和性別控制，主要是為了增強受體的雄性體性、提高養(yǎng)殖產(chǎn)量等[2]。這是因為甲基睪酮可以促進線粒體的生物合成和質(zhì)量控制，通過促進紅細胞生成和加強毛細血管來增加組織的凈氧輸送，使得動物體內(nèi)蛋白合成和肌肉增長的速率加快，其主要通過影響魚體的性類固醇激素含量，如雌二醇、睪酮等水平進而誘導雌魚雄性化，也可通過影響硬骨魚類性別分化相關(guān)基因的表達，來達到控制性別的目的[3]。甲基睪酮的生長促進作用與生長激素的代謝升高有關(guān)。

由于甲基睪酮的特殊作用，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中會存在違法使用甲基睪酮的行為。據(jù)報道，不同含量的甲基睪酮對魚類生長、代謝和發(fā)育等生理過程具有不同程度的影響。目前已有報到，甲基睪酮成功誘導了羅非魚（Oreochromis mossambicus）和虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、點帶石斑魚（Epinephelus coioides）等多種魚類發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，研究發(fā)現(xiàn)用含有 50 mg·kg-1和 100 mg·kg-117α- 甲 基 睪 酮 的 飼 料投喂出膜后15 d的大口黑鱸60 d，均獲得100%的雄 性率[4]。 研究表明，用 0 mg·kg-1、100 mg·kg-1和250 mg·kg-1濃度的甲基睪酮處理中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis），發(fā)現(xiàn)不同組之間沒有顯著差異，然而在500 mg·kg-1和1 000 mg·kg-1的高劑量下，東方河對蝦生長性能顯著增強，但是性腺發(fā)育延遲，這與之前的研究一致，即快速性腺發(fā)育會對水生物種的生長性能產(chǎn)生負面影響[5]。穆迎春等[6]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的甲基睪酮對魚類的生長具有促進作用，而高濃度則會產(chǎn)生抑制作用，濃度為1～5 mg·L-1可促進金魚和鯉魚生長；濃度為10～50 mg·L-1會導致金魚或羅非魚由雌性向雄性完全逆轉(zhuǎn)；濃度為100 mg·L-1以上可使異育銀鯽變?yōu)橹行圆挥~。因此，甲基睪酮的使用量非常關(guān)鍵，會對水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)生不同的影響。

1.2 甲基睪酮殘留的危害

甲基睪酮被作為一種性激素和強壯劑添加到飼料中時，雖然具有增加水產(chǎn)品產(chǎn)量和控制性別等優(yōu)勢，但是這類激素在動物體內(nèi)代謝緩慢、不易分解，當人體食用含有甲基睪酮殘留的水產(chǎn)品時會對自身身體健康造成巨大危害，導致肝中毒或其他重要組織器官發(fā)生生理病變，甚至具有潛在的致畸、致癌、致突變性。有研究表明，甲基睪酮代謝時間長，對人類的危害是慢性、長期和累積性的。甲基睪酮的危害主要表現(xiàn)在痕量殘留會干擾人體內(nèi)自然激素的平衡，導致正常人生理功能紊亂，還可能造成女性消費者出現(xiàn)痤瘡、多毛、聲音變粗、閉經(jīng)、乳腺退化和性欲改變等男性化現(xiàn)象，甚至對新生兒有致畸作用，干擾肝內(nèi)毛細膽管的排泄功能，引起膽汁郁積性黃疸，影響兒童的正常生長發(fā)育[7]。

目前，不少國家已經(jīng)禁止在水產(chǎn)品養(yǎng)殖中使用此種激素，并要求水產(chǎn)品中不得檢出該激素。歐盟和美國都規(guī)定在養(yǎng)殖中不允許使用甲基睪酮等性激素類藥物，中國在《無公害食品 水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》（NY 5070—2002）中將甲基睪酮明確列為禁用藥物，中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中也規(guī)定甲基睪酮為禁用獸藥。

2 檢測樣品前處理方法

針對甲基睪酮的殘留檢測，其樣品前處理的主要步驟包括用有機試劑進行提取、溶液濃縮和凈化等。因水產(chǎn)品組分復雜，含有大量蛋白和脂肪，且有些成分與甲基睪酮在結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)上都相似，前處理步驟在整個檢測過程中至關(guān)重要。提取是通過化學或物理方法從物質(zhì)中制取有用成分，一般是在確保待測組分的最大提取率和減少樣品基質(zhì)中雜質(zhì)的基礎(chǔ)上選擇提取方法和溶劑。優(yōu)異的凈化條件能夠降低基質(zhì)效應(yīng)、提高方法靈敏度、保證凈化效果和回收率，因此不同基質(zhì)樣品需要采用不同的凈化方法。甲基睪酮檢測常用的前處理方法有液-液萃取技術(shù)（Liquid–Liquid Extraction，LLE）、 固 相 萃 取 技 術(shù)（Soild Phase Extraction，SPE）等[8]。樣品中甲基睪酮檢測的樣品前處理方法見表1。

2.1 液-液萃取技術(shù)

LLE是利用混合物中各組分在兩種不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而達到分離目的，通常采用漏斗振蕩或渦旋萃取兩種方式。激素類藥物殘留分析中常用的提取溶劑有甲醇、乙腈、丙酮、乙醚和乙酸乙酯等。基于溶劑自身特性和樣品基質(zhì)來說，甲醇、乙腈和丙酮易與樣品結(jié)合，提取速度快；乙醚和乙酸乙酯適于提取脂溶性化合物[8]。乙腈是甲基睪酮殘留檢測常用的有機溶劑，可將被測組分從大量內(nèi)源性物質(zhì)中分離出來，具有沉淀蛋白的作用，可減少雜質(zhì)對測定結(jié)果的干擾。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的行業(yè)標準《水產(chǎn)品中甲基睪酮殘留量的測定 液相色譜法》（SC/T 3029－2006）中采用的提取方式就是用大量的石油醚和乙腈進行液液萃取，由于液液萃取操作步驟煩瑣、成本高、需要消耗大量的有機溶劑，后期的很多研究都在選取優(yōu)化的萃取方式[14]。

2.2 固相萃取技術(shù)

在農(nóng)藥殘留檢測中，SPE是經(jīng)常會使用到的一種凈化方法，可采用不用類型的固相萃取柱凈化樣品，該方法利用目標物與吸附劑之間的作用力來保留或吸附的原理，確保達到分離效果。黃鸞玉等[10]比較 了 ODS-C18柱（200 mg/3 mL） 和 poly-sery HLB（60 mg/3 mL）對水產(chǎn)樣品提取液的凈化效果，結(jié)果表明C18柱回收率低于50%，HLB柱回收率可達90%，因此選擇HLB柱凈化樣品。李佩佩等[11]建立了水產(chǎn)品中甲基睪酮殘留的高效液相色譜的測定方法，在樣品前處理階段選擇LC-C18柱進行凈化實驗，結(jié)果表明該方法在7.0～200 μg·kg-1添加范圍內(nèi)的平均回收率為82.0%～86.0%。萬譯文等[12]選擇了4種不同的固相萃取柱（C18500 mg/3 mL、HLB60 mg/3 mL、Alumina-N 60 mg/3 mL和 PCX 60 mg/3 mL）比較對甲基睪酮的凈化效果，最后選擇了Alumina-N中性氧化鋁柱（60 mg/3 mL），此固相萃取-高效液相色譜法步驟簡單，凈化效果好。

3 甲基睪酮的檢測方法

目前，國內(nèi)外對水產(chǎn)品中甲基睪酮殘留檢測方法進行了相應(yīng)的研究和報導，研究較多的主要有高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[13]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）法[14-16]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Liquid Chromatography Tandem mass Spectrometry，LC-MS/MS）[17-19]、酶聯(lián)免疫吸附測定法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）[20]、毛細管電泳法（Capillary Electrophoresis，CE）[21]和化學發(fā)光法[22]。水產(chǎn)品中甲基睪酮檢測方法比較見表2。

表2 水產(chǎn)品中甲基睪酮檢測方法比較表

3.1 高效液相色譜法

色譜法是在甲基睪酮檢測中應(yīng)用較為普遍的一種方法，其檢測的準確度和靈敏度較高，主要包括液相色譜和氣相色譜，SC/T 3029－2006就明確了使用液相色譜的方法。近些年來通過對此檢測方法應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，此方法樣品處理步驟繁多，檢測限較高，為10 μg·kg-1；回收率低于70%，不適合用于批量檢測，需要對其進行進一步的改良。陳培基等[23]在《水產(chǎn)品中甲基睪酮殘留量的測定 液相色譜法》（SC/T 3029－2006）標準的基礎(chǔ)上，改進了樣品前處理和色譜條件，建立了測定甲基睪酮的高效液相色譜條件。彭家杰等[24]研究優(yōu)化了高效液相色譜法中的樣品轉(zhuǎn)移操作、濃縮和凈化流程、色譜條件等，使回收率和工作效率都得到了提高。黃鸞玉等[10]通過優(yōu)化提取凈化方法，建立了超高效液相色譜分析方法，檢出限為5.0 μg·kg-1，提高了工作效率，減少了試劑消耗量。

3.2 色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法是有機物定性、定量分析的有利工具。REGAL等[25]采用液質(zhì)聯(lián)用的方法（LC-MS）測定甲基睪酮的含量，發(fā)現(xiàn)該方法的檢測限小于5.0 μg·kg-1，有效提高了測定的靈敏度與準確度。羅柏華[26]建立了液相色譜－電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測定的方法，該方法的定量限范圍為0.1 μg·L-1；楊霄等[27]建立了分散固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中甲基睪酮殘留量的方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲基睪酮在1～200 ng·mL-1線性關(guān)系良好，方法的檢出限為0.5 μg·kg-1，定量限為 1.0 μg·kg-1，用該法對羅非魚、中華鱉、凡納濱對蝦進行3個水平的加標回收試驗，回收率為82.4%～96.3%，相對標準偏差均不大于6.98%。

3.3 免疫分析學方法

免疫分析法是利用毒物與標記毒物競爭性結(jié)合抗體檢測毒物的方法，適合于復雜基質(zhì)中痕量組分的分析。DAZKIEWICZ等[28]報道了測定魚飼料和豬飼料中甲基睪酮的殘留方法為直接競爭性酶聯(lián)免疫方法和膠體金免疫層析法，其檢測結(jié)果與氣相色譜-質(zhì)譜分析方法結(jié)果一致，說明該法可廣泛應(yīng)用于甲基睪酮的殘留檢測。LUA等[29]建立了牛尿中甲基睪酮的酶聯(lián)免疫檢測法，檢測限為266 pg·mL-1。王強等[30]建立了間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定水產(chǎn)品中甲基睪酮殘留，發(fā)現(xiàn)該方法的抑制中濃度IC50為3.48 μg·L-1。夏武強等[31]通過膠體金標免疫層析技術(shù)（Goldimmunochromatographicas Say，GICA） 建 立了甲基睪酮快速測試方法，將待測樣品中的甲基睪酮和試紙條檢測線上包被的人工抗原甲基睪酮偶聯(lián)抗原（MT-BSA）競爭性結(jié)合金標結(jié)合墊上包被的膠體金-甲基睪酮單抗聚合物，根據(jù)檢測線呈現(xiàn)的紅色線條深淺來判定樣品的陰陽性，發(fā)現(xiàn)測試時間僅需10～15 min，試紙條的最低檢測限達到10 μg·kg-1。

3.4 其他檢測技術(shù)

除了高效液相色譜法、色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法、免疫分析學方法之外，還有毛細管電泳-紫外檢測法（檢出限1 μg·mL-1）、化學發(fā)光檢測法等其他檢測方法。

4 結(jié)語

甲基睪酮是一種人工合成的雄性激素，添加在水產(chǎn)品的飼料中可以提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進蛋白質(zhì)合成，提高動物生長速率。但是甲基睪酮代謝緩慢，蓄積性強，通過食物鏈進入人體會產(chǎn)生嚴重的副作用，因此對甲基睪酮殘留檢測就顯得尤為重要。目前國內(nèi)關(guān)于高效準確檢測甲基睪酮在水產(chǎn)品中殘留的研究尚不完善，有待于進一步的開發(fā)和探索。對于甲基睪酮的前處理方法，相較于的行業(yè)標準SC/T 3029—2006中液-液萃取技術(shù)，現(xiàn)在更常用的是能減少溶劑消耗，有效降低樣品基質(zhì)效應(yīng)的固相萃取技術(shù)。目前對于檢測方法的研究主要有高效液相色譜法，該方法使用儀器價格適中，檢測的準確度和靈敏度較高，可滿足日常檢測的需要，但是前處理步驟復雜、耗時長、不適合批量檢測；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法前處理方法簡單、能快速檢測水中激素殘留，但是儀器價格昂貴；氣相色譜-質(zhì)譜法具有靈敏度高、試驗數(shù)據(jù)可靠等優(yōu)點，但需要對分析物進行衍生化，結(jié)果不穩(wěn)定；酶聯(lián)免疫吸附法是公認的操作簡便、快速的檢測方法，具有特異性強、靈敏、簡便、準確和樣品通量高等優(yōu)點，但缺點是無法精準定性定量，只能用作初步篩查。時代發(fā)展對藥物殘留相應(yīng)的配套檢測技術(shù)提出了快速、準確的要求。因此探索前處理方法簡便、自動化程度高的檢測技術(shù)用于水產(chǎn)品中甲基睪酮殘留檢測，將具有較為廣闊的應(yīng)用前景。