石玉芝,陳 芳,許 劍*
(1.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院藥學部;2.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院感染性疾病科,重慶 400120)
肝竇阻塞綜合征(hepatic sinusoidal obstruction syndrome,HSOS),又稱為肝靜脈閉塞病(Hepatic veno-occlusive disease, HVOD),是由各種原因導致的肝血竇、肝小靜脈和小葉間靜脈內皮細胞水腫、壞死、脫落進而形成微血栓,引起肝內淤血、肝損傷和門靜脈高壓的一種肝臟血管性疾病[1]。其常見的原因主要有造血干細胞移植前大劑量化療、攝入含吡咯烷生物堿(PA)的中草藥、放射治療、器官移植、長期口服避孕藥及飲酒等[2]。其中,服用含有PA的植物藥物是發(fā)展中國家HSOS的主要病因,在我國主要由土三七引起[3-4],但具體的發(fā)病機制尚不明確。本研究目的在于初步探索土三七致HSOS可能的靶基因,為HSOS的精準治療及預防提供可能的理論依據。
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗動物 選用24只健康SPF級雄性SD大鼠,體重(200±20 g),由川北醫(yī)學院實驗動物中心提供[ 生產許可證號:SCXK(川)2018-18;使用許可證號:SYXK(川)2018-076]。所有動物飼養(yǎng)于川北醫(yī)學院實驗動物中心,飼養(yǎng)環(huán)境為層流潔凈飼育室,溫度為室溫22~25 ℃,相對濕度40%~70%,晝夜明暗交替12 h/12 h;自由飲食、飲水,大鼠適應喂養(yǎng)1周,觀察無不良反應后,納入實驗。本研究經重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會審查(倫理審批號:2010JC012)。
1.1.2 藥材和試劑 土三七由重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院藥學部從安徽省亳州市藥材總公司中藥公司購買,Trizol試劑(購于Thermo Fisher Scientific有限公司),福爾馬林液由川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科提供。
1.2 實驗方法
1.2.1 土三七灌胃藥液的制備 將土三七打粉,每次取150 g置于砂鍋中,加入900 mL水浸泡2 h,煎煮1.5 h后,濾出藥渣,得到藥液A;繼續(xù)加水600 mL煎煮1 h,濾出藥渣,得到藥液B,將藥液A和藥液B置于煎藥鍋中,濃縮至150 mL,即得到藥液濃度為1.0 g/mL土三七藥液。
1.2.2 實驗動物分組和干預 分組方法:將24只雄性大鼠分籠喂養(yǎng),適應性喂養(yǎng)1周后以隨機數字表法隨機分為土三七高濃度組、中濃度組、低濃度組及空白對照組,每組6只。
干預方法:各組大鼠每日同一時間灌胃1次,高濃度組、中濃度組、低濃度組分別按照 [20 g/(Kg·d)]、[10 g/(kg·d)]、[5 g/(kg·d)]的劑量以土三七藥液灌胃,給予空白對照組相應的生理鹽水灌胃,1次/d。所有SD大鼠灌胃前稱體重,根據體重變化調整當日灌胃劑量。
1.2.3 肝組織病理檢查 灌胃4周后,以引頸法處死大鼠,剖腹取大鼠肝臟組織,留取部分肝組織備用,生理鹽水沖洗后用福爾馬林液固定,行肝組織HE染色及MASSON染色,證實HSOS形成情況。
1.2.4 通過基因芯片篩選靶基因 將肝臟病理檢查證實為HSOS的大鼠的肝組織提取RNA,以膽汁淤積、脂肪變性、磷脂病、肝細胞毒性、致癌性、炎癥壞死等相關標志物84個基因和12個內參基因組成96孔基因芯片(靶基因列表見表1)以篩選可能的致病靶基因。隨后通過Western blot法進一步炎癥靶基因蛋白表達水平及其上下游相關蛋白表達水平。
表1 PCR array篩選基因列表
1.3 統計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行統計學方法,PCR array描述RNA倍數變化采用2△△CT法[5],Western blot結果采用檢測指標灰度值與內參灰度值之比進行計量分析,計量資料采用t檢驗,用(±s)表示,P<0.05為差異有統計學意義。
2.1 大鼠生存情況 造模第1周結束時,高濃度組死亡5只,剩余1只在第2周內死亡。至第4周造模結束時,中濃度組大鼠存活3只,低濃度組大鼠存活4只,對照組大鼠無死亡發(fā)生。
2.2 大鼠肝臟病理學變化 高濃度組大鼠在造模2周內全部死亡,故無4周后的病理結果。造模4周結束,光鏡下觀察,低濃度組、中濃度組各組大鼠HE染色顯示肝小葉結構紊亂,多個小葉出血、壞死,肝細胞明顯減少或消失,伴灶性纖維素樣滲出,部分可見含鐵血黃素沉積,門靜脈、中央靜脈、肝竇不同程度擴張、淤血,部分中央靜脈閉塞。MASSON染色可見門靜脈周圍及中央靜脈內皮下纖維化,部分中央靜脈閉塞。中濃度組大鼠上述病理改變較為典型。對照組大鼠肝組織肝小葉結構完整,肝細胞以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀排列,MASSON染色未見纖維蛋白沉積(圖1)。
圖1 造模4周結束時大鼠肝臟病理形態(tài)(光鏡×200)
2.3 大鼠肝組織靶基因PCR array篩查 在84個目標基因中發(fā)現具有明顯倍數關系(>2倍)變化的基因有Ccng1、Cdkn1a、Pdgfra、Cd68、Thrsp、Serpine1、Cav1、Hmox1 8個基因。結合病理特征進一步篩選發(fā)現,中濃度組大鼠serpine1轉錄水平較空白組明顯較低,差異有統計學意義(P<0.05),而低濃度組與空白對照組大鼠比較差異無統計學意義(P>0.05);除此之外,尚有Ccng1、Cdkn1a兩個基因,低濃度、中濃度與空白組大鼠對比倍數差異均具有統計學意義(P<0.05)且低濃度組與中濃度組間差異無統計學意義(P>0.05),見表2。
表2 PCR array具有明顯倍數關系的基因表
2.4 肝竇內皮細胞損傷相關蛋白檢測 Western blot檢測顯示,中濃度土三七組大鼠肝組織serpine1蛋白表達水平低于空白組表達水平(P<0.05),低濃度土三七組大鼠serpine1蛋白表達水平與空白組比較無顯著差異(P>0.05)(圖2);中濃度土三七組大鼠基質金屬肽酶9(MMP-9)蛋白表達水平明顯高于空白組表達水平,差異有統計學意義(P<0.05),低濃度土三七組大鼠MMP9蛋白表達水平與空白組表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)(圖3);中濃度土三七組大鼠谷胱甘肽(GSH)蛋白表達水平低于空白組,差異有統計學意義(P<0.05);低濃度土三七組大鼠GSH蛋白表達水平與空白組表達水平比較無顯著差異(P>0.05)(圖4)。
圖2 Western blot檢測大鼠肝組織serpine1蛋白水平
圖3 Western blot檢測大鼠肝組織MMP9蛋白水平
圖4 Western blot檢測大鼠肝組織GSH蛋白水平
土三七,又名菊三七,屬于菊科,具有止血、散瘀、消腫等功效,是我國民間常用的治療跌打損傷的中草藥。菊科的土三七與主產自云南的五加科三七(參三七)容易混淆[6],二者均具有止血、消腫等功效,而土三七含有PA,過量服用后可引起肝竇阻塞綜合征(HSOS)。國內報道的HSOS病例約有半數以上為服用土三七所致[7]?;颊甙l(fā)病后主要的臨床表現為肝區(qū)疼痛、肝大和腹水,總死亡率可高達67%,除了肝移植外尚無特異性的治療手段[8]。本研究發(fā)現,給予大鼠高劑量土三七[20 g/(Kg·d)]灌胃1周后,死亡率超過80%,2周內死亡率為100%,這說明高劑量的土三七具有較強的毒性及致死性。
土三七含有較高劑量的PA,其在肝細胞色素p450的代謝下,最終代謝產物與細胞蛋白及DNA反應后生成“吡咯代謝物或代謝吡咯”,其中一部分降解為次生毒性代謝物,誘發(fā)急慢性或遺傳毒性,造成肝細胞功能紊亂、壞死甚至組織損傷[9]。本實驗造模4周,光鏡下觀察大鼠肝組織,土三七低、中濃度各組大鼠HE染色均可見不同程度門靜脈、中央靜脈、肝竇的擴張、淤血,肝細胞壞死及匯管區(qū)炎癥細胞浸潤;MASSON染色顯示不同程度纖維組織增生,符合HSOS的病理特征。這表明服用低、中濃度土三七灌胃4周可成功誘導大鼠HSOS的形成,以中濃度組較為明顯,且隨著劑量的增加,致死性隨之增加。
肝竇內皮細胞損傷在HSOS 發(fā)病中起著重要作用[6]。本研究經PCR array檢測發(fā)現,中濃度大鼠肝組織中serpine1轉錄水平較空白組明顯較低(P<0.05),而低濃度組與空白對照組無差異(P>0.05)。這說明中濃度土三七可通過內皮細胞損傷途徑導致HSOS,serpine1可能是其作用的靶點。Serpine1是serpine超家族的絲氨酸蛋白酶抑制劑,其可由包括內皮細胞、巨噬細胞、肝細胞、平滑肌細胞和血小板等多種細胞合成[10],其與慢性肝病的發(fā)生發(fā)展密切相關[11]。Serpine1敲除的小鼠MMP-9活性增加[12],MMP9表達的增加與HSOS的發(fā)展密切相關[13]。本研究發(fā)現,中濃度土三七組隨著serpine1蛋白水平的降低,MMP9蛋白表達水平升高。可以推測,中濃度土三七通過內皮細胞損傷途徑引起serpine1表達降低,繼而引起MMP9蛋白的表達升高,從而導致HSOS。
PA代謝產物可與GSH或半胱氨酸反應形成毒性較弱或無毒的產物。肝竇內皮細胞GSH耗竭在HSOS發(fā)病中起重要作用。當GSH含量減少時,毒性物質形成增加,從而導致肝竇內皮細胞受損,典型表現以肝腺泡Ⅲ區(qū)為主的肝竇內皮細胞腫脹、損傷、脫落,肝竇顯著擴張充血;肝細胞不同程度地腫脹、壞死,紅細胞滲入狄氏間隙,肝內小靜脈管壁增厚,管腔狹窄、閉塞,無纖維化表現或可見匯管區(qū)輕度纖維增生[14]。本研究發(fā)現中濃度土三七組GSH蛋白表達水平低于空白組,推測土三七可能通過下調肝竇內皮細胞谷胱甘肽的合成或耗竭,引起內皮細胞損傷,從而導致HSOS的發(fā)生。
另外,本研究通過PCR Array實驗還發(fā)現,低濃度、中濃度土三七所致大鼠肝組織中的Ccng1和Cdkn1a的轉錄水平明顯高于空白組(P<0.05)。細胞周期蛋白G1(Ccng1)和Cdkn1a是參與細胞周期調節(jié)的關鍵酶,是多個miRNA的靶點[15]。miRNA可在調節(jié)基因轉錄過程中與靶細胞相互作用誘導細胞死亡,已成為藥物性肝損傷的重要機制[16-17],具體機制有待闡明。
土三七通過下調肝竇內皮細胞谷胱甘肽的合成,引起肝竇內皮細胞serprine1表達下降,繼而引起MMP表達水平升高,最終引起HSOS。這初步揭示了土三七可能的致病機制,為探索土三七所致HSOS的分子機制提供了一定的理論依據。