中國(guó)林蛙不同生長(zhǎng)階段哈蟆油中PUFAs與FAD關(guān)聯(lián)性

孫敬蒙 汪卓明 郭 毅 宋燕青* 張煒煜

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院臨床藥學(xué)部，長(zhǎng)春，130021；2.博納西亞(合肥)醫(yī)藥科技有限公司，合肥，230000；3.吉林省藥品審核查驗(yàn)中心，長(zhǎng)春，130062；4.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春，130117)

中國(guó)林蛙(Ranachensinensis)屬兩棲綱(Amphibia)，無尾目(Anura)，蛙科(Ranidae)，蛙屬[1]，是我國(guó)著名的集食補(bǔ)、保健和美容于一體的經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的兩棲類藥用動(dòng)物[2]，蝌蚪期和冬眠期均存活于水中，變態(tài)后幼、成蛙在每年的春天結(jié)束前完成冬眠，隨后開始地面生活。吉林省長(zhǎng)白山山脈區(qū)域是中國(guó)林蛙最佳產(chǎn)地。哈蟆油(oviductus ranae)為中國(guó)林蛙雌蛙輸卵管的干制品[3]，是中國(guó)林蛙主要的生理藥效作用部位，且富含多種對(duì)人體有益的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)。PUFAs對(duì)于兩棲冬眠動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育有重要意義，是構(gòu)成生物機(jī)體內(nèi)部脂肪的一種重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。PUFAs的合成是一個(gè)較為復(fù)雜的過程，它是以飽和脂肪酸硬脂酸(stearic acid，SA)為底物，通過脂肪酸伸長(zhǎng)酶和脫氫酶的一系列作用完成的，其中碳鏈的延長(zhǎng)與脫氫過程是相互交替進(jìn)行的。在合成途徑中[4]，脂肪酸脫氫酶(fatty acid dehydrogenase，F(xiàn)AD)是關(guān)鍵酶[5]，它控制著目標(biāo)PUFAs的不飽和程度[6]，Δ6-FAD是動(dòng)物脂肪酸生物合成的第一限速酶，是PUFAs合成途徑中的關(guān)鍵酶；Δ5-FAD是合成PUFAs途徑中的第二個(gè)限速酶；Δ9-FAD是一種可溶性FAD[7]。

PUFAs和FAD在中國(guó)林蛙的其他組織部位中表達(dá)量的情況目前沒有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以吉林省靖宇縣中國(guó)林蛙全年6個(gè)生長(zhǎng)階段采集的3齡雌蛙樣本為研究對(duì)象，以輸卵管組織為研究部位，探討FAD基因表達(dá)量和PUFAs含量的相關(guān)性，以期確定中國(guó)林蛙哈蟆油最佳采收期，為其養(yǎng)殖和采收提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)動(dòng)物

依據(jù)中國(guó)林蛙生活習(xí)性及繁殖方式，將生長(zhǎng)期劃分為6個(gè)階段：出蟄期(2—3月)、產(chǎn)卵期(3—5月)、捕食期(5—9月)、入蟄期(9—11月)、散居冬眠期(11—12月)和群居冬眠期(12—2月)。在吉林省靖宇縣按中國(guó)林蛙生長(zhǎng)階段采集3齡雌蛙，每個(gè)不同生長(zhǎng)階段的樣本量最少為6只。解剖取得中國(guó)林蛙的輸卵管部位，冰箱-80 ℃凍存。

2 研究方法

2.1 中國(guó)林蛙哈蟆油PUFAs含量測(cè)定

采用StatView分析脂肪酸的組成及相對(duì)含量。

2.1.1 氣相色譜條件

Agilent 7890B色譜儀，SPTM-2560毛細(xì)管色譜柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm)，載氣為高純氮?dú)?99.999%)，氣化室溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度260 ℃；程序升溫：初始溫度100 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至240 ℃，保持30 min；總運(yùn)行時(shí)間70 min。分流進(jìn)樣(分流比為50∶1)，進(jìn)樣量為1 μL；色譜柱流速為0.507 7 mL/min，H2流速為40 mL/min，空氣流速為400 mL/min，尾吹流速為30 mL/min。

2.1.2 溶液的配制

內(nèi)標(biāo)物溶液：精密稱取十七烷酸甲酯5 mg，置于5 mL量瓶中，加正己烷至刻度，搖勻，備用。

對(duì)照品溶液：精密量取100 μL 17種脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品(Supelco 17 Component FAME Mix，純度≥98%)置2 mL量瓶中，加正己烷至刻度，混勻，備用。

供試品溶液：稱取約1 g中國(guó)林蛙輸卵管組織，加入焦性沒食子酸、0.9%NaCl溶液、十七烷酸甲酯內(nèi)標(biāo)溶液，置于離心管中，勻漿，繼續(xù)加入甲醇、氯仿，1 500 r/min，離心5 min，吸取下層溶液。剩余上層溶液中加氯仿、生理鹽水，1 500 r/min，離心5 min，吸取下層溶液；剩余上層溶液中繼續(xù)加氯仿、生理鹽水，1 500 r/min，離心5 min，吸取下層溶液；合并3次吸取的下層溶液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀氮?dú)獯蹈?。加入鹽酸-甲醇溶液，100 ℃加熱30 min，取出放置至室溫，加入去離子水、石油醚，1 500 r/min，離心5 min，吸取上層溶液，下層溶液繼續(xù)加入石油醚，渦旋，取出上層溶液，重復(fù)3次，合并上層溶液；加入去離子水，充分振蕩3 min，1 500 r/min，離心5 min，棄去下層溶液，反復(fù)操作，將上層溶液洗至pH 5.0～6.0后，加入無水硫酸鈉，靜置，將液體倒出，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀氮?dú)獯蹈?，用正己烷充分溶解并定容? mL。

2.1.3 線性關(guān)系考察

精密吸取十七烷酸甲酯溶液(1 mg/mL)0.06、0.09、0.12、0.18、0.24 mL，分別置于1 mL量瓶中，加正己烷定容至刻度，搖勻，配成不同濃度的十七烷酸甲酯溶液。依次注入氣相色譜儀測(cè)定，記錄峰面積，以色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。

2.2 PUFAs合成相關(guān)FAD表達(dá)量測(cè)定

2.2.1 中國(guó)林蛙哈蟆油RNA的提取

取不同生長(zhǎng)階段的中國(guó)林蛙輸卵管組織置于預(yù)冷的研缽中，同時(shí)向研缽中傾入液氮保持低溫并將其研成粉末，取50～100 mg輸卵管粉末于離心管中，加入TRIzol約10 mL，振搖，碎冰中靜置5 min，加入氯仿200 μL，振搖后插入碎冰中靜置5 min，于4 ℃離心機(jī)中，14 000 r/min離心15 min。吸取上層清液置新離心管中，加入等體積的異丙醇，倒置并充分混搖，在0 ℃碎冰中放置10 min，隨后在4 ℃離心機(jī)中，12 000 r/min離心10 min。棄上清液，向下層沉淀中加入1 mL經(jīng)過DEPC水處理后的75%乙醇，4 ℃離心機(jī)中，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，于碎冰中靜置1 min，吸取20 μL DEPC水溶解RNA沉淀，待測(cè)。

2.2.2 cDNA反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)

吸取RNA Marker 10×Loading Buffer 2 μL與樣品混勻，注入電泳槽電泳15 min。紫外燈下可見，電泳帶區(qū)間有3條清晰的亮帶。

采用SYBR Green法去除基因組DNA。反應(yīng)體系：5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，RNA 1.0 μL，RNase Free H2O 6 μL，混合液在42 ℃條件下反應(yīng)2 min，之后于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser-Perfect Real Time試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系：Reaction solution 10 μL，5×PrintScript Buffer 2 10 μL，PrintScript RT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，RNase Free H2O 4 μL，總體積20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?7 ℃，15 min；85 ℃，5 s；PCR程序結(jié)束后自動(dòng)降溫至4 ℃保存，將得到的cDNA在-20 ℃保存。

2.2.3 cDNA熒光定量測(cè)定

選取EF1-α作為內(nèi)參基因。采用TaKaRa公司的SYBR Premix EXTaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒，其定量部分均在Mx3000PTMReal time PCR儀上操作，操作系統(tǒng)為StrataGene Mx3000P。反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL，Passiue Refeerence Dye(50×)0.4 μL，PCR Forword Primer(10 μmol/L)0.4 μL；PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μL；DEPC水6.8 μL，cDNA 2 μL。兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：95 ℃預(yù)變性，30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線95 ℃，5 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s。采用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量。

2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

用SPSS 19.0對(duì)中國(guó)林蛙不同生長(zhǎng)階段哈蟆油中OA、ALA、AA、EPA和DHA含量聚類分析，采用離差平方和法，以歐氏距離為區(qū)間聚類。依據(jù)中國(guó)林蛙不同生長(zhǎng)階段哈蟆油總PUFAs含量與OA、ALA、AA、EPA和DHA含量及相對(duì)基因表達(dá)量的數(shù)據(jù)，使用SPSS 19.0和R 4.0.1進(jìn)行相關(guān)性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 系統(tǒng)適用性

以十七烷酸甲酯濃度(X)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=2 034.700X+11.146，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，表明十七烷酸甲酯內(nèi)標(biāo)的線性關(guān)系良好(圖1)。以十七烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)，17種混合脂肪酸為混標(biāo)(圖2)，測(cè)定了供試品含量，得到氣相色譜圖(圖3)。

圖1 內(nèi)標(biāo)物(十七烷酸甲酯)色譜圖Fig.1 Chromatogram of internal standard (methyl heptadecanoate)

圖2 17種混合脂肪酸混標(biāo)色譜圖Fig.2 Mixed standard chromatograms of 17 fatty acid methyl esters

圖3 哈蟆油PUFAs供試品色譜圖Fig.3 Chromatogram of the test product of PUFAs

3.2 中國(guó)林蛙哈蟆油PUFAs含量

采用“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定不同生長(zhǎng)階段中國(guó)林蛙哈蟆油總PUFAs含量及OA、ALA、AA、DHA、EPA含量(表1)。由表1可見，中國(guó)林蛙在散居冬眠期時(shí)哈蟆油中總PUFAs含量及OA、ALA、AA、DHA、EPA含量最高。

表1 不同生長(zhǎng)階段中國(guó)林蛙哈蟆油中PUFAs含量

由圖4可見，6個(gè)生長(zhǎng)階段中國(guó)林蛙哈蟆油樣品可聚為三大類：散居冬眠期單獨(dú)聚為一類，記為第1類，此類總PUFAs和5種重要PUFAs含量位列首位，明顯高于總體平均值；入蟄期和群居冬眠期聚為一類，記為第2類，此類總PUFAs、OA和EPA含量略高于總體平均值，ALA、AA和DHA含量與總體平均值相似；出蟄期、產(chǎn)卵期和捕食期聚為一類，記為第3類，此類總PUFAs和5種重要PUFAs含量均低于總體平均值。綜上可知，不同生長(zhǎng)階段中國(guó)林蛙哈蟆油中PUFAs含量存在明顯差異，其中散居冬眠期各PUFAs含量較高，其次為入蟄期和群居冬眠期，最低為出蟄期、產(chǎn)卵期和捕食期。

圖4 中國(guó)林蛙不同生長(zhǎng)階段哈蟆油PUFAs含量聚類分析樹狀圖Fig.4 Dendrogram of cluster analysis of PUFAs content in oviductus ranae at different growth stages of Rana chensinensis

3.3 FAD表達(dá)量

中國(guó)林蛙不同生長(zhǎng)階段哈蟆油PUFAs合成相關(guān)FAD的表達(dá)情況如表2所示。由表2可見，中國(guó)林蛙全年不同生長(zhǎng)階段哈蟆油中各個(gè)基因的表達(dá)，基本在散居冬眠期達(dá)到峰值；Δ6-FAD、Δ5-FAD和Δ9-FAD基因表達(dá)量在出蟄期—捕食期先升高后降低；Δ6-FAD、Δ5-FAD和Δ9-FAD基因的表達(dá)量在捕食期—散居冬眠期不斷升高；Δ6-FAD和Δ9-FAD基因在散居冬眠期—群居冬眠期時(shí)表達(dá)水平下調(diào)；Δ5-FAD基因在散居冬眠期—群居冬眠期時(shí)表達(dá)水平有所提高；n-3FAD1和n-3FAD2基因在全年都處于一個(gè)相對(duì)較穩(wěn)定隨外界氣溫降低有所升高的表達(dá)量水平。

表2 不同生長(zhǎng)階段中國(guó)林蛙哈蟆油FAD相對(duì)表達(dá)量

3.4 相關(guān)性分析

3.4.1 不同生長(zhǎng)階段PUFAs之間的相關(guān)性

依據(jù)相關(guān)性分析(表3)可見，不同生長(zhǎng)階段OA、ALA、AA、EPA、DHA含量與總PUFAs均具有強(qiáng)相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)均大于0.8)，這可能與總PUFAs與單獨(dú)PUFA具有相同的合成和代謝途徑有關(guān)，因而含量具有相似的變化趨勢(shì)和強(qiáng)相關(guān)性。其中OA和EPA的置信度小于0.05，與總PUFAs具有顯著相關(guān)性，可認(rèn)為兩者在中國(guó)林蛙哈蟆油采集時(shí)期的鑒別上具有重要意義。

3.4.2 不同生長(zhǎng)階段各PUFAs含量與基因相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性

由表3可見，在中國(guó)林蛙不同生長(zhǎng)階段哈蟆油樣本中，各基因的表達(dá)量與各生長(zhǎng)階段總PUFAs含量相關(guān)性強(qiáng)弱順序?yàn)棣?-FAD(0.94)>Δ5-FAD(0.91)>Δ9-FAD(0.89)>n-3FAD2(0.87)>n-3FAD1(0.72)，其中Δ9-FAD、n-3FAD1、n-3FAD2基因表達(dá)量與總PUFAs含量有強(qiáng)相關(guān)性，但其置信度均大于0.05，故不具有顯著相關(guān)性；僅有Δ6-FAD和Δ5-FAD基因的表達(dá)量與總PUFAs含量具有顯著相關(guān)性(P<0.05)。在各基因表達(dá)量與單獨(dú)PUFA含量相關(guān)性分析中：Δ6-FAD基因表達(dá)量與各生長(zhǎng)階段OA和EPA含量具有顯著相關(guān)性(P<0.05)，與ALA具有強(qiáng)相關(guān)性；Δ5-FAD基因表達(dá)量與各生長(zhǎng)階段OA、AA和EPA含量具有強(qiáng)相關(guān)性；Δ9-FAD基因表達(dá)量與各生長(zhǎng)階段OA、ALA和EPA含量均有顯著相關(guān)性(P<0.05)；n-3FAD1和n-3FAD2基因表達(dá)量與各生長(zhǎng)階段AA、EPA含量有強(qiáng)相關(guān)性。

表3 總PUFAs含量與單獨(dú)PUFA含量、基因表達(dá)量的相關(guān)性

4 討論

在本研究中，供試林蛙為吉林省靖宇縣人工包山封溝放養(yǎng)的中國(guó)林蛙。連續(xù)3年采收每個(gè)生長(zhǎng)階段的中國(guó)林蛙，每個(gè)階段的樣本量最少為6只，試驗(yàn)誤差均在合理誤差范圍內(nèi)。研究表明，Δ6-FAD、Δ5-FAD、Δ9-FAD、n-3FAD1和n-3FAD2在散居冬眠期時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，即在中國(guó)林蛙生長(zhǎng)的11—12月達(dá)到最大值，說明此時(shí)中國(guó)林蛙哈蟆油中PUFAs的合成達(dá)到1年中的頂峰，依據(jù)PUFAs含量測(cè)定結(jié)果也可看出該時(shí)期中國(guó)林蛙哈蟆油中的PUFAs含量最高。Δ6-FAD、Δ5-FAD和Δ9-FAD基因表達(dá)量在出蟄期—捕食期先升高后降低，出蟄期—產(chǎn)卵期升高可能是中國(guó)林蛙在產(chǎn)卵期時(shí)需要大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，這其中必然包括大量PUFAs的合成，Δ6-FAD、Δ5-FAD和Δ9-FAD基因表達(dá)的酶在OA、ALA、AA、EPA和DHA等PUFAs的合成中具有關(guān)鍵作用，中國(guó)林蛙需要提高這幾種基因的表達(dá)來滿足自身產(chǎn)卵的營(yíng)養(yǎng)需求。產(chǎn)卵期—捕食期降低可能是中國(guó)林蛙剛剛產(chǎn)卵，身體中營(yíng)養(yǎng)消耗較多并開始進(jìn)入捕食期，通過捕食進(jìn)行自身營(yíng)養(yǎng)的補(bǔ)充；另一方面，中國(guó)林蛙進(jìn)入捕食期后，外界溫度升高，體內(nèi)已無需高比例的PUFAs來維持生命體征，故調(diào)控體內(nèi)PUFAs合成的關(guān)鍵酶基因，Δ6-FAD、Δ5-FAD和Δ9-FAD受到該信號(hào)影響，降低表達(dá)水平。在捕食期—散居冬眠期，Δ6-FAD、Δ5-FAD和Δ9-FAD基因的表達(dá)量不斷升高，可能是因?yàn)橹袊?guó)林蛙在捕食期后體內(nèi)存有大量的糖類、蛋白質(zhì)和脂肪酸等，進(jìn)入入蟄期和散居冬眠期時(shí)外界環(huán)境溫度開始驟降，中國(guó)林蛙為在寒冷的環(huán)境中生存，需合成大量的PUFAs維持自身細(xì)胞膜的流動(dòng)性，受此外界信號(hào)的調(diào)節(jié)，升高Δ6-FAD、Δ5-FAD和Δ9-FAD基因的表達(dá)水平。在散居冬眠期—群居冬眠期，Δ6-FAD和Δ9-FAD基因表達(dá)水平下調(diào)，可能由于此時(shí)中國(guó)林蛙已進(jìn)入冬眠期，體內(nèi)已合成較多的PUFAs，基本可以滿足抗寒和維持生命之需。Δ5-FAD基因在中國(guó)林蛙體內(nèi)與EPA的合成關(guān)系較為密切，而EPA在促進(jìn)脂肪酸代謝，減少血液黏度(減少血小板凝血功能)、清理血管垃圾等方面具有重要作用。中國(guó)林蛙在冬眠時(shí)需要維持血液的循環(huán)通暢，使得Δ5-FAD基因在散居冬眠期—群居冬眠期時(shí)表達(dá)水平提高，從而增加體內(nèi)EPA的含量。

n-3FAD1和n-3FAD2基因與n-3系列PUFAs的合成有重要的關(guān)系，n-3系列的PUFAs不僅是生物細(xì)胞膜的重要組分，且在生物體內(nèi)具有重要的生理功能。正因?yàn)閚-3系列PUFAs在生物體內(nèi)舉足輕重的地位，n-3FAD1和n-3FAD2基因在全年都處于一個(gè)相對(duì)較穩(wěn)定、且隨外界氣溫的降低有所升高的表達(dá)量水平，以此保障中國(guó)林蛙體內(nèi)n-3系列PUFAs的正常合成。

Δ6-FAD在PUFAs的形成中起著極為重要的作用，其在不飽和脂肪酸的第6位和第7位碳原子脫氫[8]，從而引入雙鍵，是PUFAs合成途徑中的關(guān)鍵酶。在合成途徑中，Δ6-FAD基因主要調(diào)控OA、ALA、AA和DHA等重要PUFAs的合成和代謝，故其在PUFAs積累過程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用。Δ5-FAD是合成 PUFAs 途徑中的第二個(gè)限速酶，Δ5-FAD基因是調(diào)控AA、EPA等重要PUFAs合成的關(guān)鍵基因。由于Δ6-FAD和Δ5-FAD基因表達(dá)量與總PUFAs含量及所調(diào)控的重要單獨(dú)PUFA含量有顯著相關(guān)性，可認(rèn)為Δ6-FAD和Δ5-FAD的基因表達(dá)量在中國(guó)林蛙不同生長(zhǎng)階段哈蟆油的鑒別上具有重要意義。

PUFAs和FAD的關(guān)聯(lián)性在其他蛙類物種中未見文獻(xiàn)報(bào)道，這種關(guān)聯(lián)機(jī)制將在后續(xù)試驗(yàn)中繼續(xù)探討。中國(guó)林蛙在冬季大約有6個(gè)月的冬眠期，在低溫環(huán)境下只有維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性才可確保細(xì)胞膜執(zhí)行正常的生理功能[9]。細(xì)胞膜的流動(dòng)性與脂肪酸組成密切相關(guān)，脂肪酸中PUFAs的流動(dòng)性比飽和脂肪酸更強(qiáng)。因此，PUFAs的變化規(guī)律對(duì)于維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、膜的流動(dòng)性以及酶的活性具有非常重要的作用。變溫動(dòng)物或恒溫動(dòng)物能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜中脂肪酸的飽和程度來適應(yīng)外界環(huán)境溫度的變化，而這種適應(yīng)能力主要是通過FAD對(duì)脂肪酸的去飽和催化作用來實(shí)現(xiàn)的。本研究表明中國(guó)林蛙冬眠時(shí)，哈蟆油中FAD關(guān)鍵基因的表達(dá)量增加，從而增加PUFAs合成量，保證其能安全度過冬眠期。

5 結(jié)論

通過對(duì)中國(guó)林蛙不同生長(zhǎng)階段哈蟆油進(jìn)行PUFAs測(cè)定及關(guān)鍵酶基因表達(dá)量測(cè)定，并采用SPSS 19.0和R 4.0.1對(duì)測(cè)得數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，得出中國(guó)林蛙哈蟆油最佳采收期為散居冬眠期，即每年的11—12月。

對(duì)不同生長(zhǎng)階段中國(guó)林蛙哈蟆油總PUFAs含量與單獨(dú)PUFA含量進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)OA、ALA、AA、EPA、DHA含量與總PUFAs均具有強(qiáng)相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)均大于0.8)，僅OA、EPA與總PUFAs具有顯著相關(guān)性，在哈蟆油采集時(shí)期的鑒別及質(zhì)量評(píng)價(jià)上具有重要參考價(jià)值。

對(duì)不同生長(zhǎng)階段中國(guó)林蛙哈蟆油總PUFAs含量與單獨(dú)PUFA含量、基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了相關(guān)性分析，Δ9-FAD、n-3FAD1、n-3FAD2基因表達(dá)量與總PUFAs含量有強(qiáng)相關(guān)性；僅有Δ6-FAD和Δ5-FAD基因的表達(dá)量與總PUFAs含量具有顯著相關(guān)性，因此，Δ6-FAD和Δ5-FAD基因的表達(dá)量在哈蟆油采集時(shí)期的鑒別及質(zhì)量評(píng)價(jià)上具有重要參考價(jià)值。