基于mtDNA D-loop區(qū)和Cyt b基因序列對(duì)鵝喉羚南疆亞種遺傳多樣性與系統(tǒng)進(jìn)化地位的分析

張永浩 韋慶浩 郭麗君 阿布都熱合曼·吐爾遜 王玉濤

(喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，喀什，844000)

鵝喉羚(Gazellasubgutturosa)又稱長(zhǎng)尾黃羊，屬偶蹄目(Artiodactyla)反芻亞目(Ruminantia)?？?Bovidae)羚羊亞科(Antilopinae)瞪羚屬[1]，雄性鵝喉羚在發(fā)情時(shí)期喉部會(huì)膨大(即甲狀腺腫)，形似鵝喉，因此稱其為鵝喉羚。據(jù)報(bào)道[2]，鵝喉羚有6個(gè)亞種，在新疆境內(nèi)分布3種，近50年，由于人為因素(包括牧業(yè)的發(fā)展、過(guò)度捕獵和居民點(diǎn)擴(kuò)充等)和自然災(zāi)害(全球氣候變化、風(fēng)雪嚴(yán)寒引起的食物短缺等)的影響，該物種的棲息環(huán)境越來(lái)越差，活動(dòng)范圍逐漸縮小，種群數(shù)量也迅速減少，面臨更加嚴(yán)重的生存危機(jī)[3-5]。鵝喉羚已被列為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，IUCN紅色名錄VU級(jí)(易危種)[6]，《中國(guó)脊椎動(dòng)物紅色名錄》易危物種(VU)[7]。

鵝喉羚多棲息于荒漠和半荒漠地區(qū)，以及沙土和黏土至鹽灘及沙漠類型的區(qū)域。鵝喉羚全球分布廣泛，從伊朗、阿拉伯半島、中亞和阿富汗，向東拓展至中國(guó)的西北地區(qū)和蒙古境內(nèi)的廣大區(qū)域[8]。雌性鵝喉羚生角部位顯著凸起，雄獸具角，角長(zhǎng)22～30 cm[9]。我國(guó)學(xué)者[10-11]已對(duì)鵝喉羚進(jìn)行了多方面的研究，如形態(tài)與分類學(xué)、棲息地的選擇和覓食繁殖等，也有學(xué)者[12-13]將鵝喉羚的研究動(dòng)態(tài)進(jìn)行了整理，對(duì)其分類、地理分布、種群數(shù)量、生理、生化、細(xì)胞生物學(xué)、生態(tài)生物學(xué)和飼養(yǎng)繁殖與疾病防治進(jìn)行了總結(jié)，探討致危因素，提出保護(hù)對(duì)策，然而，從遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育地位為切入點(diǎn)，對(duì)鵝喉羚南疆亞種(G.s.yarkandensis)的保護(hù)制定合理措施的研究鮮有報(bào)道，本研究將彌補(bǔ)這一空缺。

線粒體DNA(mtDNA)是動(dòng)物體內(nèi)唯一的核外遺傳物質(zhì)，呈共價(jià)閉合環(huán)狀，且為雙鏈DNA，序列長(zhǎng)15～20 kb，分子質(zhì)量極小[14]。在哺乳綱(Mammalia)動(dòng)物中，編碼區(qū)和非編碼區(qū)構(gòu)成了完整的mtDNA結(jié)構(gòu)，37個(gè)基因的編碼序列呈線性排列在編碼區(qū)，包括13個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因、22個(gè)編碼tRNA的基因和2個(gè)編碼rRNA的基因。mtDNA從雌性親本個(gè)體傳遞給子代，過(guò)程中沒有發(fā)生基因重組現(xiàn)象，后代中的某一個(gè)體可以代表其母系群體的遺傳結(jié)構(gòu)，能夠保留祖先的特性并記錄之前出現(xiàn)的進(jìn)化事件，但是線粒體基因比核基因更容易受遺傳漂變的影響[15]?；趍tDNA的以上特點(diǎn)，mtDNA分子標(biāo)記技術(shù)在脊椎動(dòng)物群體遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)和母系起源等領(lǐng)域的研究中得到普遍運(yùn)用。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，人們對(duì)Cytb基因的結(jié)構(gòu)了解越來(lái)越深入，它的相對(duì)分子質(zhì)量約為427 000[3，16]，密碼子的第3位點(diǎn)進(jìn)化最快，而第2位點(diǎn)最保守[17]。為明確鵝喉羚南疆亞種遺傳多樣性水平、遺傳分化和系統(tǒng)進(jìn)化地位，以鵝喉羚南疆亞種為研究對(duì)象，采用PCR和測(cè)序技術(shù)，研究mtDNA D-loop區(qū)和mtDNACytb基因的序列特征，下載GenBank中鵝喉羚基因序列，利用MEGA 6.06構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和中介網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，以闡明鵝喉羚南疆亞種遺傳多樣性水平和系統(tǒng)地位，為鵝喉羚的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為鵝喉羚南疆亞種遺傳資源保護(hù)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在葉城地區(qū)采集到鵝喉羚3份肌肉樣本，在英吉沙縣和莎車縣分別采集到3份和8份耳部樣本，共采集14份樣本(分屬于14只個(gè)體)，均來(lái)自南疆地區(qū)，系野外死亡個(gè)體，將樣本編號(hào)后凍存(-80 ℃)于新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣本處理及DNA提取

取50～100 mg樣本，用剪刀盡量剪碎，裝于高壓滅菌過(guò)的2 mL離心管中，加入800 μL STE抽提液，再加入蛋白酶K和十二烷基硫酸鈉(SDS)充分混勻15 min，消化過(guò)夜后用常規(guī)酚-氯仿法提取總基因組DNA[18]。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

mtDNACytb基因上游引物為5′-GATATGAAAAACCATCGTTG-3′，下游引物為5′-CCTTCTCTGGTTTACAAGAC-3′[19]。反應(yīng)總體系為50.5 μL，其中，上、下游引物各1.0 μL，2×TaqPCR Master Mix 30.0 μL，DNA模板2.5 μL，ddH2O 16.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。mtDNA D-loop區(qū)上游引物為5′-CCACTATCAACACCCAAAGCTG-3′，下游引物為5′-GCATTTTCAGTGCCTTGCT-3′[20]?？偡磻?yīng)體系為50.5 μL，其中，上、下游引物各1.0 μL，2×TaqPCR Master Mix 30.0 μL，DNA模板2.5 μL，ddH2O 16.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，61.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳及送樣測(cè)序

PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，若目的條帶清晰整齊，條帶較亮，無(wú)雜帶，且mtDNACytb基因片段長(zhǎng)度與預(yù)期的1 100 bp相近，mtDNA D-loop區(qū)序列片段長(zhǎng)度與預(yù)期的1 000 bp相近，即可由蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行正反向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)Chromas version 2.65軟件對(duì)DNA測(cè)序儀產(chǎn)生的原始序列峰圖數(shù)據(jù)進(jìn)行人工校對(duì)。在MEGA 6.06中對(duì)mtDNA D-loop區(qū)和mtDNACytb基因的序列測(cè)定結(jié)果進(jìn)行人工多序列同源比對(duì)，輔以Clustal軟件校對(duì)，校對(duì)后的文件保存為Fasta和MEGA格式。采用DnaSP v5軟件計(jì)算核苷酸多樣度、單倍型多樣度和平均核苷酸差異數(shù)。用MEGA 6.06軟件構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹，分析樣品網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝喉羚mtDNA D-loop區(qū)和Cyt b基因組成

由圖1可見，mtDNA D-loop區(qū)和Cytb基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果較好，雜峰、套峰少，波谷波峰界限明確，不存在誤讀情況，可進(jìn)行后續(xù)序列分析。

圖1 鵝喉羚mtDNA D-loop區(qū)和Cyt b基因PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果Fig.1 PCR products sequencing results of mtDNA D-loop region and Cyt b gene in Gazella subgutturosa

將mtDNA D-loop區(qū)的測(cè)序結(jié)果和GenBank中的鵝喉羚mtDNA控制區(qū)序列進(jìn)行同源對(duì)比，最終獲得14條線粒體控制區(qū)序列，長(zhǎng)度為791 bp。使用MAGE 6.06對(duì)所得序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和鳥嘌呤(G)的平均含量分別為33.18%、27.20%、21.87%和17.75%，其中鳥嘌呤含量最低，A+T的平均含量為60.38%，G+C的平均含量為39.62%，堿基組成存在明顯的偏向性，這一特征符合脊椎動(dòng)物mtDNA的序列特征。

將mtDNACytb基因的序列測(cè)序結(jié)果和GenBank中鵝喉羚mtDNACytb基因序列進(jìn)行同源對(duì)比，最終獲得14條線粒體控制區(qū)序列，長(zhǎng)度為1 084 bp，這與哺乳動(dòng)物Cytb基因擴(kuò)增長(zhǎng)度1 100～1 200 bp的結(jié)果[21]基本吻合。使用MAGE 6.06分析所得序列，結(jié)果顯示：A、T、C和G的平均含量分別為31.58%、26.71%、28.71%和13.01%，其中鳥嘌呤的含量最低，G+C的平均含量(41.72%)顯著低于A+T的平均含量(58.39%)，與mtDNA D-loop區(qū)類似，具有明顯的堿基偏向性，這一特征同樣符合脊椎動(dòng)物的基因序列特征。

2.2 鵝喉羚單倍型多樣性

通過(guò)DnaSP v5軟件對(duì)14條鵝喉羚mtDNA D-loop區(qū)序列進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果顯示共存在7種單倍型(Hap1～Hap7)，其中有3種為共享單倍型，Hap3有2個(gè)個(gè)體，Hap5有6個(gè)個(gè)體，Hap6有2個(gè)個(gè)體，占總單倍型的42.86%；4個(gè)為單一單倍型，Hap1、Hap2、Hap4、Hap7，占總單倍型的57.14%。在莎車縣采集的8個(gè)樣本屬于2個(gè)單倍型，分別為Hap5和Hap6；在葉城縣采集的3個(gè)樣品屬于3個(gè)單倍型，分別為Hap2、Hap3和Hap4；在英吉沙縣采集的3個(gè)樣本屬于3個(gè)單倍型，其中1個(gè)與葉城縣采集的樣本為共享單倍型Hap3，另外2個(gè)單倍型為Hap1和Hap7(表1)。本研究檢測(cè)到保守性位點(diǎn)共762個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)共23個(gè)，占總位點(diǎn)數(shù)的2.90%，其中包括單一多態(tài)位點(diǎn)8個(gè)，位于第60、84、157、213、221、241、358和771堿基位，簡(jiǎn)約性信息位點(diǎn)15個(gè)，位于第135、142、199、200、246、337、356、357、440、455、722、723、729、741和743堿基位。

表1 鵝喉羚南疆亞種mtDNA D-loop區(qū)的7個(gè)單倍型變異序列

通過(guò)DnaSP v5軟件對(duì)14條鵝喉羚mtDNACytb基因序列進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果顯示：存在5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，共4種單倍型(Hap1～Hap4)，其中有3種為共享單倍型：Hap1有5個(gè)個(gè)體，Hap2有6個(gè)個(gè)體，Hap4有2個(gè)個(gè)體，占總單倍型的75%；Hap3為單一單倍型，占總單倍型的25%。在莎車縣采集的8個(gè)樣本屬于2個(gè)單倍型，分別為Hap2和Hap4；在葉城縣采集的3個(gè)樣品屬于2個(gè)單倍型，分別為Hap1和Hap3；在英吉沙縣采集的3個(gè)樣品與在葉城縣采集的2個(gè)樣品屬于共享單倍型Hap1(表2)。通過(guò)DnaSP v5軟件對(duì)14條基因序列的1 084個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，沒有檢測(cè)到堿基插入和缺失。本研究檢測(cè)到保守性位點(diǎn)共1 079個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)共5個(gè)，占總位點(diǎn)數(shù)的0.46%，其中包括單一多態(tài)位點(diǎn)1個(gè)，位于第558堿基位，簡(jiǎn)約性信息位點(diǎn)4個(gè)，分別位于第130、525、615和690堿基位。

表2 鵝喉羚南疆亞種mtDNA Cyt b基因的4個(gè)單倍型變異序列

2.3 鵝喉羚的遺傳多樣性

14只鵝喉羚南疆亞種的mtDNA D-loop區(qū)序列、mtDNACytb基因平均單倍型多樣度分別為0.813和0.714，核苷酸多樣度為0.008 90和0.001 59，平均核苷酸差異度為7.747和1.725，表明鵝喉羚南疆亞種mtDNA D-loop區(qū)和mtDNACytb基因的單倍型多樣度水平較高，核苷酸多樣度水平低，遺傳多樣性較高。

2.4 鵝喉羚的系統(tǒng)發(fā)育

結(jié)合所得數(shù)據(jù)，下載GenBank中瞪羚屬的mtDNA D-loop區(qū)同源序列，比對(duì)分析共獲得36條長(zhǎng)度為1 084 bp的序列，經(jīng)單倍型分析后獲得29條序列。使用MAGE 6.06的Kimura 2-parameter(雙參數(shù))模型，用鄰接法構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)拓?fù)鋱D進(jìn)行自展檢驗(yàn)，重復(fù)抽樣次數(shù)設(shè)置為1 000，以GenBank中山瞪羚(Gazellagazella)mtDNA D-loop區(qū)的序列作為外群，結(jié)果見圖2。本研究中的7種單倍型與山瞪羚位于完全不同的2個(gè)進(jìn)化支系上，表明親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；單倍型Hap1、Hap2、Hap4、Hap6、Hap3和Hap7聚類于進(jìn)化支系E，Hap5聚類于進(jìn)化支系F，且進(jìn)化支系E和F中還包含了GenBank中鵝喉羚南疆亞種的序列，表明同一亞種的親緣關(guān)系較近，7種單倍型聚類于進(jìn)化支系I。

圖2 鵝喉羚mtDNA D-loop區(qū)序列單倍型的NJ系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 NJ phylogenetic tree constructed by the sequence haplotypes in the mtDNA D-loop region of Gazella subgutturosa

結(jié)合所得數(shù)據(jù)，下載GenBank中瞪羚屬mtDNACytb基因同源序列，將測(cè)序獲得的序列比對(duì)和矯正，共獲得35條長(zhǎng)度為1 084 bp的序列，經(jīng)單倍型分析后獲得25條序列。以印度瞪羚(Gazellabennettii)的mtDNACytb基因序列作為外群，結(jié)果見圖3。4種單倍型聚類于進(jìn)化支系Ⅰ，且其中3種單倍型與GenBank中南疆亞種位于同一進(jìn)化支系C，1種單倍型與GenBank中鵝喉羚北疆亞種(Gazellasubgutturosasairenses)位于同一進(jìn)化支系D，說(shuō)明親緣關(guān)系南疆亞種高于北疆亞種。

圖3 鵝喉羚mtDNA Cyt b基因序列單倍型的NJ系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 NJ phylogenetic tree constructed by the sequence haplotypes of mtDNA Cyt b region of Gazella subgutturosa

2.5 鵝喉羚網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

使用MEGA 6.06構(gòu)建的南疆亞種鵝喉羚和GenBank中下載的20條mtDNA D-loop區(qū)序列的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系(圖4)與系統(tǒng)發(fā)育樹顯示的結(jié)果(圖2)一致。鵝喉羚與山瞪羚(Hap8)呈現(xiàn)明顯不同的2個(gè)分支，且鵝喉羚的各亞種聚為2個(gè)分支，未出現(xiàn)低頻單倍型以高頻單倍型為中心的散射分布，說(shuō)明單倍型的遺傳結(jié)構(gòu)比較單一，基因交流較少。

圖4 鵝喉羚各亞種間mtDNA D-loop區(qū)序列網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig.4 Sequence network diagram of mtDNA D-loop region among various subspecies of Gazella subgutturosa 注：GSY.鵝喉羚南疆亞種；GSS.鵝喉羚北疆亞種；GSM.鵝喉羚阿拉伯亞種；GSSu.鵝喉羚指名亞種；GG.山瞪羚 Note：GSY，Gazella subgutturosa yarkandensis.GSS，Gazella subgutturosa sairenses.GSM，Gazella subgutturosa marica.GSSu，Gazella subgutturosa subgutturosa.GG，Gazella gazella

使用MEGA 6.06構(gòu)建的南疆亞種鵝喉羚和GenBank中下載的23條mtDNACytb序列的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系(圖5)與系統(tǒng)發(fā)育樹顯示的結(jié)果(圖3)一致。鵝喉羚與印度瞪羚(Hap14)屬于不同分支，且鵝喉羚的各亞種聚為2個(gè)分支，未出現(xiàn)低頻單倍型以高頻單倍型為中心的散射分布，說(shuō)明倍型的遺傳結(jié)構(gòu)比較單一，基因交流較少。

圖5 鵝喉羚各亞種間mtDNA Cyt b基因序列網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig.5 Sequence network diagram of mtDNA Cyt b region among various subspecies of Gazella subgutturosa 注：GSY.鵝喉羚南疆亞種；GSS.鵝喉羚北疆亞種；GSM.鵝喉羚阿拉伯亞種；GSSu.鵝喉羚指名亞種；GB.印度瞪羚 Note：GSY，Gazella subgutturosa yarkandensis.GSS，Gazella subgutturosa sairenses.GSM，Gazella subgutturosa marica.GSSu，Gazella subgutturosa subgutturosa.GB，Gazella bennettii

3 討論

本研究對(duì)14只鵝喉羚南疆亞種mtDNACytb基因進(jìn)行分析，在4種堿基中，鳥嘌呤的含量最低，G+C的平均含量(41.72%)顯著低于A+T的平均含量(58.28%)，與mtDNA D-loop區(qū)序列類似，具有明顯的堿基偏向性，這一特征符合脊椎動(dòng)物的基因序列特征。鵝喉羚南疆亞種平均單倍型多樣度為0.714，核苷酸多樣度為0.001 59，表明mtDNACytb基因的單倍型多樣度水平較高，遺傳多樣性較高，但與董潭成等[22]對(duì)卡拉麥里山鵝喉羚mtDNACytb基因的研究結(jié)果對(duì)比，2個(gè)參數(shù)均有減弱趨勢(shì)；相比于夏米西丁·阿不都熱依木[23]對(duì)新疆鵝喉羚mtDNACytb基因的研究，本研究所得的核苷酸多樣度較高，平均單倍型多樣度略低。因此，應(yīng)完善南疆喀什地區(qū)鵝喉羚棲息地的保護(hù)措施，為其種群提供適合的棲息地環(huán)境，可參照馬可·波羅盤羊(Ovisammonpolii)保護(hù)措施建立鵝喉羚生態(tài)公園，進(jìn)行人工擴(kuò)繁，同時(shí)開展精、卵冷凍保存庫(kù)離體保護(hù)[24]。為全面反應(yīng)群體的多樣性水平，還需要基于更多的基因?qū)z傳多樣性開展進(jìn)一步研究。

鵝喉羚南疆亞種與其他亞種間不存在共享單倍型，可能是因?yàn)轾Z喉羚在遷徙到葉爾羌河流域后，與其他地區(qū)鵝喉羚群體間基因交流較少，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的適應(yīng)性進(jìn)化，形成了獨(dú)特的遺傳結(jié)構(gòu)，成為現(xiàn)今的南疆亞種。鵝喉羚南疆亞種的保護(hù)措施應(yīng)進(jìn)行完善和加強(qiáng)，尤其是近幾年冬季氣溫不斷降低，降雪量增加，對(duì)鵝喉羚冬季的生存，尤其是覓食造成了很大的影響，建議有關(guān)部門在冬季采取適當(dāng)措施以降低鵝喉羚冬季覓食的難度。