硒化甘草多糖對(duì)雛雞免疫和抗氧化功能的影響

丁 艷，李 劼，羅 燕，王 虹，武夢(mèng)麗，連科迅 ，谷新利

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003)

免疫應(yīng)激是畜禽生產(chǎn)中普遍存在的問(wèn)題，在畜牧業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)中，畜禽不可避免的受到免疫應(yīng)激。當(dāng)畜禽受到免疫應(yīng)激時(shí)，機(jī)體免疫系統(tǒng)被激活，產(chǎn)生免疫應(yīng)答以抵抗微生物入侵，同時(shí)引起機(jī)體一系列行為和代謝上的改變，導(dǎo)致畜禽生長(zhǎng)遲緩、生產(chǎn)性能下降、免疫功能減弱。因此，為了保障畜禽健康和改善生產(chǎn)性能，使用天然植物提取物緩解動(dòng)物機(jī)體因免疫應(yīng)激導(dǎo)致的負(fù)面影響則顯得尤為重要。在建立動(dòng)物免疫應(yīng)激模型時(shí)，最經(jīng)典和目前使用最普遍的是給動(dòng)物注射細(xì)菌脂多糖(LPS)[1]，誘導(dǎo)動(dòng)物形成免疫應(yīng)激狀態(tài)。

甘草(Glycyrrhiza)作為一種常用的重要中藥， 被冠以 “眾藥之王” 稱號(hào)， 其藥用價(jià)值倍受人們的廣泛關(guān)注。近年來(lái)大量研究表明，甘草具有重要的生物活性和藥理作用，影響細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)免疫功能和生理功能也有重要的調(diào)節(jié)作用[2]。甘草多糖(Glycyrrhizapolysaccharide，GP)是甘草的主要活性成分之一，其生物活性與空間結(jié)構(gòu)和以α-D-吡喃多糖為主的空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[3]。目前，已經(jīng)證明甘草多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、抑菌、抗炎抗病毒等活性[4-5]。有報(bào)道甘草多糖能通過(guò)多條途徑增強(qiáng)免疫功能，能激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)[6]，具有抗補(bǔ)體活性[7]，直接刺激B淋巴細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)人體中IgM、IgG的產(chǎn)生，還能誘生和促誘生干擾素，增強(qiáng)機(jī)體殺傷細(xì)胞的活性[8]。硒是生命活動(dòng)所必需的微量元素之一，參與構(gòu)成氧化酶的活性中心，通過(guò)提高機(jī)體的抗氧化活性，增強(qiáng)對(duì)機(jī)體對(duì)相關(guān)疾病的抵抗能力[9]。硒多糖既能保持多糖的基本構(gòu)型和生理功能，又能有效提髙硒的生物利用度，發(fā)揮微量元素硒和多糖的雙重功能[10]。蛋雞在生產(chǎn)過(guò)程中面臨著抗病力差、免疫功能低以及易受外界應(yīng)激源刺激等問(wèn)題，因此，專家學(xué)者不斷探索開發(fā)新的免疫增強(qiáng)劑，但硒化甘草多糖(seleniumGlycyrrhizapolysacccharide，Se GUP)作為免疫調(diào)節(jié)劑對(duì)蛋雞免疫功能影響的研究較少。本研究將硒化甘草多糖用于蛋雞，探討其對(duì)蛋雞免疫功能和抗氧化功能的影響，為硒化甘草多糖在蛋雞養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 多糖 黃芪多糖，購(gòu)自重慶永健生物技術(shù)有限責(zé)任公司；烏拉爾甘草多糖，由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院中獸醫(yī)教研室提供。

1.1.2 試驗(yàn)用動(dòng)物 1日齡京紅1號(hào)雛雞300只，購(gòu)自新疆中盛峪口禽業(yè)有限公司。

1.1.3 主要試劑 脂多糖(LPS)，Sigma公司產(chǎn)品；免疫球蛋白M(IgM)試劑盒、免疫球蛋白G(IgG)試劑盒、免疫球蛋白A(IgA)試劑盒、可溶性CD4分子(SCD4)試劑盒、可溶性CD8分子(SCD8)試劑盒、補(bǔ)體蛋白3(C3)試劑盒、補(bǔ)體蛋白4(C4)試劑盒，上海紀(jì)寧生物科技有限公司產(chǎn)品；總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)測(cè)試盒、丙二醛(MDA)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 壓蓋型真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；Biotek SynergeyTM2多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司產(chǎn)品；紫外可見分光光度計(jì)，北京萊伯泰科儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 硒化甘草多糖的制備 參照文獻(xiàn)[11]，采用水提醇沉法從烏拉爾甘草中提取出烏拉爾甘草多糖，經(jīng)三氯乙酸、過(guò)氧化氫、DEAE-52層析柱及Sephadex G-100層析柱純化，利用Na2SeO3硒化修飾得到硒化甘草多糖。

1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物處理及飼養(yǎng)管理 300只1日齡體重相近的健康京紅1號(hào)雛雞，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組、LPS組、LPS+黃芪多糖組(1 mg/mL)、LPS+GP(1 mg/mL)組、LPS+硒化甘草多糖(1 mg/mL)組。除空白組外，其余組雛雞于試驗(yàn)第8、10、12天腹腔注射LPS(1.5 mg/kg體重)建立免疫應(yīng)激模型，從12日齡開始，多糖組連續(xù)給藥7 d，0.5 mL/只，空白組給予相同體積的生理鹽水。雛雞采用網(wǎng)上平養(yǎng)方式，自由采食和飲水。7日齡雞用新城疫+傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗點(diǎn)眼免疫，14日齡雞用傳染性法氏囊病疫苗滴口免疫，21日齡雞用新城疫+傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗點(diǎn)眼與新城疫+傳染性支氣管炎支二聯(lián)滅活苗肌注免疫，28日齡雞用禽流感二價(jià)滅活苗免疫。試驗(yàn)期為46 d。

1.2.3 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

1.2.3.1 樣品采集 分別于試驗(yàn)第18、25、32、39、46天，每組隨機(jī)選取10只雞進(jìn)行心臟采血，傾斜靜置，常溫下制備血清。待血清析出后，3 000 r/min離心10 min，收集上清液，置-20℃保存待測(cè)。

1.2.3.2指標(biāo)測(cè)定 免疫指標(biāo)測(cè)定:IgM、IgG、IgA、SCD4、SCD8、C3、C4含量按照試劑盒說(shuō)明采用ELISA方法測(cè)定。抗氧化指標(biāo)測(cè)定:T-AOC、SOD、GSH-PX和MDA含量或活性按照試劑盒說(shuō)明采用生化法測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 硒化甘草多糖對(duì)雛雞血清免疫指標(biāo)的影響

由表1可知，與空白對(duì)照組相比，注射LPS顯著提高了雛雞18日齡和25日齡IgA含量(P<0.05)，而注射GP、硒化甘草多糖和黃芪多糖顯著降低了雛雞25日齡IgA含量(P<0.05)，各給藥組差異不顯著(P>0.05)；LPS組雛雞18、25、32、39日齡IgG和IgM含量顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，給予GP、硒化甘草多糖和黃芪多糖顯著降低了雛雞IgG和IgM含量(P<0.05)，且18日齡和25日齡雛雞各給藥組間IgG含量差異顯著(P<0.05)；LPS組雛雞18日齡C3、C4含量顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，給予GP、硒化甘草多糖和黃芪多糖顯著降低了C3、C4含量(P<0.05)，但各給藥組差異不顯著(P>0.05)；LPS 組雛雞18、25、32日齡SCD4含量顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，給予GP、硒化甘草多糖和黃芪多糖顯著提高了SCD4含量，且25日齡雛雞各給藥組間差異顯著(P<0.05)。

2.2 硒化甘草多糖對(duì)雛雞血清抗氧化能力的影響

由表 2可知，與空白對(duì)照組相比，LPS組顯著降低了雛雞18日齡和25日齡T-AOC含量(P<0.05)，而注射GP、硒化甘草多糖和黃芪多糖顯著提高了雛雞T-AOC含量(P<0.05)，GP組和硒化甘草多糖組T-AOC含量差異不顯著(P>0.05)，黃芪多糖組T-AOC含量顯著高于GP組和硒化甘草多糖組(P<0.05)；與空白對(duì)照組相比，LPS組顯著降低了雛雞18、25、32、39、46日齡SOD活性，而注射GP、硒化甘草多糖和黃芪多糖顯著提高了雛雞SOD活性(P<0.05)，但各給藥組間SOD活性差異不顯著(P>0.05)；與空白對(duì)照組相比，LPS組顯著降低了雛雞18、25、32、39 日齡GSH-PX活性，而注射GP、硒化甘草多糖和黃芪多糖顯著提高了雛雞GSH-PX活性(P<0.05)，且黃芪多糖組GSH-PX活性顯著高于GP組和硒化甘草多糖組(P<0.05)，硒化甘草多糖組GSH-PX活性顯著高于甘草多糖組(P<0.05)；與空白對(duì)照組相比，LPS組顯著提高了雛雞18、25、32、39、46日齡MDA含量，而注射GP、硒化甘草多糖和黃芪多糖顯著降低了雛雞MDA含量(P<0.05)，但各給藥組間SOD活性差異不顯著(P>0.05)。

表1 硒化甘草多糖對(duì)雛雞血清免疫指標(biāo)的影響

表2 硒化甘草多糖對(duì)雛雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

3 討論

3.1 硒化甘草多糖對(duì)雛雞血清免疫指標(biāo)的影響

體液免疫反應(yīng)能夠預(yù)防大多數(shù)細(xì)菌及某些病毒感染機(jī)體[12]，機(jī)體血清免疫球蛋白(Ig)的含量能反映機(jī)體體液免疫功能的強(qiáng)弱，通常檢測(cè)血清IgA、IgG、IgM 含量就可以反應(yīng)出血清免疫球蛋白的水平。Yang X J等[13]研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激可以顯著提高肉仔雞血清IgG含量。有研究表明，刺五加多糖對(duì)肉仔雞血清IgA、IgG、IgM均有不同程度的提高[14]。陳永順等[15]研究發(fā)現(xiàn)，注射甘草多糖能顯著提高小鼠血清IgM、IgG含量和抗體生成細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而增強(qiáng)小鼠的免疫功能。馬璐等[16]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加甘草多糖能提高肉雞血清中IgM含量。李昆[17]研究發(fā)現(xiàn),給肉仔雞注射LPS顯著提高了血清IgA、IgG的含量，表明注射LPS顯著地引起了機(jī)體體液免疫反應(yīng)，使機(jī)體的免疫系統(tǒng)處于過(guò)度激活的狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，給雛雞注射LPS顯著提高了血清IgA、IgG的含量，表明注射LPS顯著地引起了機(jī)體體液免疫反應(yīng)，這與前人的研究結(jié)果一致；注射硒化甘草多糖降低了LPS刺激肉仔雞血清中IgA、IgG的含量。這一結(jié)果表明，硒化甘草多糖對(duì)雛雞的體液免疫具有調(diào)節(jié)作用。這可能是因?yàn)槲什荻嗵蔷哂须p向調(diào)節(jié)免疫功能的作用，在機(jī)體處于正常狀態(tài)時(shí)可以改善雛雞的免疫功能，但在免疫系統(tǒng)被過(guò)度激活后又可以減輕自身的免疫反應(yīng)來(lái)保護(hù)機(jī)體不受傷害。

細(xì)胞免疫主要依靠T細(xì)胞發(fā)揮作用，其中誘導(dǎo)性T細(xì)胞是主要的CD4陽(yáng)性細(xì)胞，在抗原捕獲及遞呈中發(fā)揮重要作用，分泌的細(xì)胞因子可促進(jìn)其他T細(xì)胞增殖、分化、成熟；抑制性T細(xì)胞是主要的CD8陽(yáng)性細(xì)胞，可分泌T細(xì)胞抑制因子，使機(jī)體轉(zhuǎn)為免疫抑制狀態(tài)。二者相互協(xié)調(diào)、制約，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。而在外周血中CD4和CD8的可溶形式為SCD4和SCD8，正常狀態(tài)下，淋巴細(xì)胞自然釋放一定量的 SCD4和SCD8，但當(dāng)機(jī)體遭受感染時(shí)，其分泌量會(huì)發(fā)生顯著變化。因此，SCD4和SCD8可以反映機(jī)體免疫狀態(tài)[18]。劉曉靜等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在肉仔雞日糧中添加沙蒿籽粉可顯著增加血清SCD4含量(P<0.05)，降低SCD8含量，說(shuō)明日糧中添加沙蒿籽粉對(duì)肉仔雞細(xì)胞免疫功能具有一定影響。本研究發(fā)現(xiàn)，注射LPS顯著降低雛雞18日齡和25日齡時(shí)血清中SCD4的含量，而注射硒化甘草多糖可顯著提高SCD4含量。這表明硒化甘草多糖對(duì)雛雞細(xì)胞免疫有一定的調(diào)節(jié)作用。

總體來(lái)說(shuō)，硒化甘草多糖對(duì)雛雞細(xì)胞免疫和體液免疫都有一定的調(diào)節(jié)作用，可能是硒化甘草多糖促進(jìn)了免疫細(xì)胞分泌，從而達(dá)到調(diào)節(jié)免疫功能的作用。

3.2 硒化甘草多糖對(duì)雛雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

動(dòng)物在健康狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)的氧化和抗氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)[20]，但在動(dòng)物受到應(yīng)激源刺激后導(dǎo)致氧自由基的大量產(chǎn)生，致使體內(nèi)的氧化還原狀態(tài)失衡，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)平衡紊亂，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激。T-AOC是反映機(jī)體抗氧化能力的綜合指標(biāo)，其大小可以反映機(jī)體自由基代謝的狀況和機(jī)體抗氧化系統(tǒng)對(duì)外源性刺激的代償能力。SOD、GSH-PX是機(jī)體酶促抗氧化體系的主要抗氧化酶，其活性或含量可以作為評(píng)判機(jī)體抗氧化狀態(tài)的指標(biāo)；MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物之一，血清MDA含量可以反映機(jī)體內(nèi)的氧化程度，間接說(shuō)明細(xì)胞的損傷程度。有研究發(fā)現(xiàn)[17]，LPS刺激可以降低抗氧化酶SOD、GSH-PX的活性，增加MDA含量，從而使體內(nèi)的過(guò)氧化物和超氧化物含量增加，對(duì)機(jī)體造成損傷。本研究結(jié)果顯示，LPS 刺激降低了雛雞血清中T-AOC、SOD、GSH-PX的含量或活性，這表明LPS刺激打破了雛雞體內(nèi)氧化和抗氧化之間的平衡，與前人的研究結(jié)果一致。而硒化甘草多糖顯著提高了T-AOC、SOD、GSH-PX的含量或活性，顯著降低了MDA含量。表明硒化甘草多糖可以通過(guò)提高氧化應(yīng)激條件下抗氧化酶的活性和降低MDA 的含量來(lái)降低血清中過(guò)氧化物的產(chǎn)生，緩解由LPS引起的氧化應(yīng)激，維持體內(nèi)的氧化和抗氧化系統(tǒng)的平衡。

研究表明，硒化甘草多糖可以通過(guò)下調(diào)LPS刺激的雛雞血清中IgA、IgG 、IgM 、MDA的含量，提升SCD4、T-AOC、SOD、GSH-PX含量或活性，緩解了LPS刺激造成的過(guò)度免疫和脂質(zhì)過(guò)氧化，從而對(duì)雛雞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用。