186 例矮小癥患者遺傳學(xué)檢測結(jié)果分析

王莉莉 吳海瑛 謝蓉蓉 王鳳云 陳 婷 陳秀麗 孫 輝 王曉艷 張丹丹 陳臨琪

蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院內(nèi)分泌遺傳代謝科（江蘇蘇州 215000）

矮小癥是最常見的兒童內(nèi)分泌遺傳代謝疾病之一，其發(fā)病率約為3.0%～5.0%[1-2]。生長發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，受遺傳、環(huán)境、營養(yǎng)、疾病及內(nèi)分泌激素等多種因素的共同影響。其中遺傳因素約占80.0%，是成人終身高的主要決定因素[3]。由于臨床表型和遺傳異質(zhì)性，潛在的病因往往難以發(fā)現(xiàn)。隨著基因檢測技術(shù)包括拷貝數(shù)變異分析、全外顯子測序等在矮小病因研究中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)一些單基因變異、染色體片段缺失或重復(fù)是導(dǎo)致兒童矮小癥的遺傳病因[4]。但是，由于矮小癥遺傳學(xué)研究還非常有限，且基因檢測費(fèi)用較高，尚未在臨床普遍應(yīng)用。本研究的主旨為①明確哪些矮小癥患者需要進(jìn)行基因檢測，為矮小癥兒童基因檢測的臨床應(yīng)用提供依據(jù)；②明確矮小癥的相關(guān)基因，為其精準(zhǔn)診療提供基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年1月—2020年10月因生長緩慢至蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院內(nèi)分泌遺傳代謝科就診，未明確病因的186例矮小癥患兒。矮小癥診斷標(biāo)準(zhǔn)：身高低于同性別、同年齡、同種族正常健康兒童平均身高2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差以上，或低于第三百分位數(shù)（參照首都兒科研究所生長發(fā)育研究室制定的《0～18歲兒童青少年身高、體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)差單位數(shù)值表》）[2]。

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡＜16歲，符合矮小癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，伴有下列1項(xiàng)或以上表現(xiàn)，①矮小家族史，患兒父母及其家族中有1人或多人身材矮?。行裕?60 cm，女性＜150 cm）；②特殊面容，包括前額突出、眼距寬、眼瞼下垂、瞼裂長、瞼裂下斜、瞼裂上斜、斜視、藍(lán)鞏膜、鼻梁低平、高腭弓、小下頜、面中部發(fā)育不良、嘴唇厚、耳位低、招風(fēng)耳、頸短、頸蹼；③骨骼發(fā)育異常，包括四肢短、雙下肢彎曲、雞胸、漏斗胸、手指短、手指彎曲、多指（趾）、并指（趾）、脊柱畸形、馬德隆畸形、關(guān)節(jié)過度屈曲、髕骨小或缺如、骨質(zhì)異常、Chiari畸形；④先天性心臟發(fā)育異常，包括房間隔缺損、室間隔缺損、法洛四聯(lián)征、卵圓孔未閉、主動(dòng)脈狹窄、肺動(dòng)脈狹窄、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉、肺動(dòng)脈高壓；⑤其他系統(tǒng)異常，包括語言發(fā)育落后、運(yùn)動(dòng)發(fā)育落后、智力低下、泌尿生殖器畸形、聽力障礙（聽力下降、先天性感音性耳聾）、皮膚咖啡斑、多毛；⑥嚴(yán)重矮小，即身高低于同年齡、同性別兒童平均身高-3 SD 或低于父母遺傳靶身高的-3 SD；⑦無生長追趕的小于胎齡兒（SGA）。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①顱內(nèi)腫瘤、占位，顱腦外傷或放射損傷；②甲狀腺功能減退癥（甲狀腺發(fā)育不良、橋本甲狀腺炎）；③Turner綜合征；④21三體綜合征；⑤其他染色體數(shù)目異常；⑥慢性系統(tǒng)性疾病，如慢性腎臟病、血液系統(tǒng)疾病、腫瘤、長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素。

本研究獲蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：202003）及家長知情同意。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 包括矮小癥患兒的身高、年齡、性別、臨床表型、矮小家族史等資料。

1.2.2 全外顯子基因測序和基因芯片檢測 入院后采集患兒及其父母外周血各2 mL，應(yīng)用全血磁珠純化試劑盒提取DNA，利用芯片IDTxGen Exome Research Panel v 1.0 對進(jìn)行捕獲，采用 Illumina Novaseq 6000 平臺(tái)測序，測序數(shù)據(jù)經(jīng)Illumina Sequence Control Software（SCS）評估合格后，進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取和生物信息學(xué)分析。原始測序數(shù)據(jù)去除污染和接頭序列，然后利用BWA軟件（http://bio-bwa.sourceforge.net/）將過濾后的序列比對到NCBI數(shù)據(jù)庫人類基因組參考序列（hg 19）上，利用GATK 軟件（https://software.broadinstitute.org/gatk/）分析得出單核苷酸變異（single nucleotide variation，SNV）和插入缺失突變（inserts and deletions，INDEL）的相關(guān)信息。然后通過ANNOVAR 軟件（http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/）對所有的SNP 和INDEL 進(jìn)行注釋。單核苷酸變異利用SIFT（http://sift.jcvi.org/），PolyPhen-2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/），Mutation Taster（http://www.mutationtaster.org/）軟件進(jìn)行致病性預(yù)測和保守性預(yù)測。根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)院（ACMG）的最新標(biāo)準(zhǔn)和指南對候選變異進(jìn)行分類。經(jīng)過分析篩選得到的獲選變異位點(diǎn)利用PCR和Sanger測序驗(yàn)證，并在家系成員中進(jìn)行共分離驗(yàn)證。PCR引物對利用Primer 5.0設(shè)計(jì)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過Sanger測序并在ABI 3730XL DNA 測序儀（Applied Biosystems，Thermo Fisher Scientific，USA）上進(jìn)行分析。對于全外顯子基因測序發(fā)現(xiàn)的可能的染色體片段拷貝數(shù)變異進(jìn)一步完善基因芯片檢查，明確兒童矮小癥病因診斷，根據(jù)患兒臨床表型及有無矮小家族史進(jìn)行分組，比較不同分組間基因檢測的陽性率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用GraphPad軟件進(jìn)行繪圖。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（P25～P75）表示。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用二元logistic回歸模型分析矮小癥患兒基因檢測陽性的預(yù)測因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

共納入186 例矮小癥患兒，中位年齡為7.3（5.1～9.1）歲，男103例、女83例。有矮小家族史85例（45.7%），伴特殊面容52例（28.0%），伴骨骼系統(tǒng)異常51例（27.4%），SGA 26例（14.0%），伴心血管系統(tǒng)異常25例（13.4%），伴泌尿生殖系統(tǒng)畸形23例（12.4%），伴智力低下7例（3.8%），伴皮膚毛發(fā)異常5例（2.7%），伴聽力障礙3例（1.6%）。

2.2 基因檢測結(jié)果

本研究共發(fā)現(xiàn)6 9 例陽性結(jié)果，總檢出率37.1%，單基因變異54例（表1），染色體片段缺失15例（包括DiGeorge綜合征4例，Williams綜合征3例，Leri-Weill軟骨發(fā)育不全2例，16p11.2微缺失綜合征2例、Xp22.33-p22.31缺失、17p13.3缺失、15q26.3缺失、2q31.1缺失各1例）。

表1 單基因變異54例致病機(jī)制分類

2.3 基因陽性和陰性組之間臨床表型比較

根據(jù)基因檢測結(jié)果分為陽性組和陰性組。陽性組身高標(biāo)準(zhǔn)差＜-3 SD、伴骨骼發(fā)育異常、伴特殊面容、伴先天性心血管發(fā)育異常、伴＞1個(gè)異常表型的比例高于陰性組，矮小家族史的比例低于陰性組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 基因檢測陽性組與陰性組臨床表型比較[n (%)]

將85 例有矮小家族史的患兒根據(jù)是否伴有異常表型及按矮小程度分組進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，不同矮小程度組間基因檢測陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），身高標(biāo)準(zhǔn)差＜-4 SD 組的陽性率較高；有矮小家族史且伴異常表型患兒的基因檢測陽性率高于僅有矮小家族史患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 85例有矮小家族史伴或不伴其他表型及不同矮小程度組間陽性率比較

2.4 不明原因矮小癥患兒基因檢測陽性發(fā)生的預(yù)測因素

將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素納入二元logistic回歸分析，結(jié)果見表4，特殊面容和骨骼發(fā)育異常是兒童矮小癥基因檢測結(jié)果陽性發(fā)生的預(yù)測因素（P均＜0.05）。

表4 不明原因矮小癥患兒基因檢測陽性發(fā)生的預(yù)測因素

3 討論

身材矮小是患者及其家屬非常關(guān)注的問題，也是兒童內(nèi)分泌科常見的疾病之一。遺傳因素對身高變異的影響很大程度上歸因于許多不同基因的綜合作用，這意味著身高通常可能是一個(gè)多基因遺傳的復(fù)雜性狀[5-6]。然而，嚴(yán)重身材矮小往往是由單基因變異引起的，從而對身高產(chǎn)生較大的影響（如FGFR3、NPR2、ACAN等）[7]。單基因變異導(dǎo)致的疾病復(fù)雜多樣，導(dǎo)致的矮小可能是勻稱的或是非勻稱的、嚴(yán)重的或輕微的、可以發(fā)生在出生前和/或出生后[8]。此外，一個(gè)基因的不同變異類型可以導(dǎo)致不同的臨床表型譜，一種臨床表型可能是由不同的基因變異引起[9]。一些基因的變異不僅會(huì)損害骨骼生長板的發(fā)育和/或功能，還會(huì)損害非骨骼系統(tǒng)，導(dǎo)致綜合征性的矮小[10]。

近年來，遺傳學(xué)方法包括基因組測序技術(shù)和生物信息學(xué)方法，尤其是二代測序技術(shù)（next generation sequenxcing，NGS），已經(jīng)成為鑒定單基因矮小遺傳病因的重要工具[11-13]。過去下丘腦垂體-生長激素（GH）-類胰島素樣生長因子-1（IGF-1）軸被認(rèn)為是兒童生長發(fā)育的主要調(diào)控途徑[14]，然而最近研究發(fā)現(xiàn)許多新的基因變異會(huì)導(dǎo)致身材矮小，其中絕大多數(shù)不參與GH-IGF-1 系統(tǒng)。因此有研究認(rèn)為下丘腦垂體-GH-IGF-1 軸只是控制生長板軟骨生長的眾多調(diào)控系統(tǒng)之一，兒童的正常生長不僅需要正常濃度的GH 和IGF-1，還需要多種其他激素、旁分泌因子，以及軟骨細(xì)胞增殖、肥大和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生所需的多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路共同作用的調(diào)控[12,15]。根據(jù)對骨骼生長板作用的機(jī)制不同進(jìn)行分類，包括內(nèi)分泌生長激素軸信號(hào)通路、旁分泌信號(hào)、軟骨細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的遺傳缺陷[16]。調(diào)控這些信號(hào)通路上的基因變異均可導(dǎo)致身材矮小。本研究發(fā)現(xiàn)2 例GH 1基因變異，均表現(xiàn)為嚴(yán)重矮小、具有生長激素缺乏的典型面容（前額突出，眼距寬，鼻梁低平），且GH1基因復(fù)合雜合變異較單雜合變異的矮小程度更嚴(yán)重，GH激發(fā)試驗(yàn)及IGF-1檢測對于診斷有一定的幫助，明確診斷仍需借助基因測序。文獻(xiàn)報(bào)道ACAN基因變異的患兒多有骨齡超前，伴有骨骼發(fā)育異常[17]，本研究中5例ACAN基因變異患兒中，僅1例存在骨齡超前，家系中攜帶者及先證者均無骨骼發(fā)育異常，提示ACAN基因變異臨床表型譜廣泛，雖無早發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎或骨骼畸形、骨齡超前的患兒仍不能完全排除ACAN基因變異的可能。FGFR 3基因雜合變異可導(dǎo)致軟骨發(fā)育不全，臨床特征為不成比例的身材矮小，四肢短小，頭大、前額突出、面中部發(fā)育不良，“三叉手”、關(guān)節(jié)松弛，腰椎后凸畸形等[18]。本研究發(fā)現(xiàn)1例FGFR3基因變異（c.1663G＞T，p.V555L）患兒僅表現(xiàn)為身材矮小，身材比例正常，無明顯骨骼畸形，母親身高148 cm，身材勻稱。因此建議對勻稱性身材矮小且有矮小家族史的患兒，仍需要考慮FGFR3基因變異。本研究中發(fā)現(xiàn)2 例ANKRD 11基因變異導(dǎo)致的KBG 綜合征，均為尚未報(bào)道的位點(diǎn)，患兒均有典型的上頜中切牙過大、身材矮小、小指彎曲、輕中度智力落后，均無心臟發(fā)育異常。另外本研究中的男性患兒還有隱睪、異位腎的表現(xiàn)，有文獻(xiàn)報(bào)道部分KBG綜合征男性患兒可有隱睪表現(xiàn)[19]。但尚無異位腎的報(bào)道，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究在186 例矮小患兒中共檢出69 例陽性結(jié)果，僅2例為GH-IGF-1軸相關(guān)基因，23例為骨骼生長板相關(guān)基因，44 例為綜合征性相關(guān)基因。提示內(nèi)分泌GH 軸異常導(dǎo)致的矮小癥可能相對更罕見。因此建議臨床醫(yī)師除了關(guān)注GH 軸的異常，應(yīng)該更多重視骨骼發(fā)育系統(tǒng)以及其他系統(tǒng)的異常。2014年Dauber等[20]建議對所有身高低于-3SD的個(gè)體，或身高低于-2.5 SD 且具有一種或多種臨床表型（包括多發(fā)性垂體激素缺乏癥表型、明確的GH不敏感、SGA缺乏追趕成長、骨骼發(fā)育不良、智力障礙、小頭畸形及其他先天性異?；蚧危蛏砀叩陀诟改高z傳靶身高-2 SD 的患兒均應(yīng)進(jìn)行基因檢測，這些患兒可能存在單基因變異的風(fēng)險(xiǎn)，二代測序技術(shù)有助于明確其遺傳病因。2018年國內(nèi)研究者對114例中國矮小患兒依次進(jìn)行靶基因/全外顯子組測序和染色體微陣列分析，其中41 例明確了遺傳病因，陽性率為36%。其中伴有面部畸形或骨骼異?；純旱年栃月曙@著高于無相應(yīng)表型的患兒[21]。除上述研究外，國內(nèi)外的此類研究并不多，目前國內(nèi)對矮小癥的診治大多停留在傳統(tǒng)的檢測方法如GH 激發(fā)檢測、IGF-1 的測定等，但傳統(tǒng)的檢測方法僅能明確1.0%～40.0%矮小癥的病因[20,22]，仍有大部分患兒病因尚未明確。隨著遺傳學(xué)基因檢測技術(shù)的快速發(fā)展，希望可以有更多身材矮小的患兒得到明確的病因診斷，從而達(dá)到精準(zhǔn)治療。本研究對186例病因不明的身材矮小患兒進(jìn)行全外顯子測序，發(fā)現(xiàn)了69例陽性結(jié)果，其中54例為單基因變異，15例為基因芯片證實(shí)的染色體片段缺失變異，總檢出率為37.1%。

本研究共有85例患兒具有矮小家族史，其中僅有矮小家族史63例，有矮小家族史且伴有其他異常表型22例，共檢出15例陽性結(jié)果。有矮小家族史且伴有其他異常表型組的陽性率高于僅有矮小家族史不伴異常表型組，推測僅有矮小家族史的患者更多的可能是多基因遺傳[23]。當(dāng)合并有其他異常表型時(shí)，提示患者存在單基因變異的可能性較大，建議進(jìn)行基因檢測明確病因。本研究結(jié)果提示特殊面容、骨骼發(fā)育異常是兒童矮小癥基因檢測陽性發(fā)生的預(yù)測因素。這與相關(guān)研究結(jié)果一致[21]。因此對于以矮小就診且合并有特殊面容和/或骨骼發(fā)育異常的患兒，應(yīng)建議其完善基因檢測，進(jìn)一步明確矮小病因。

綜上所述，在病因不明的矮小癥患兒中存在潛在基因變異的可能，全外顯子測序技術(shù)是檢測兒童矮小癥遺傳病因的有效技術(shù)手段。兒童矮小癥的遺傳病因主要涉及GH 軸相關(guān)基因、骨骼生長板相關(guān)基因及矮小綜合征相關(guān)基因。具有特殊面容和/或骨骼發(fā)育異常患兒的診斷率明顯高于無相應(yīng)表型的患兒，提示這兩種表型可作為矮小患兒基因檢測陽性發(fā)生的預(yù)測因素，但需要收集更多的樣本來進(jìn)一步驗(yàn)證。