兒童糖尿病臨床與分子遺傳學(xué)病因分析

張開創(chuàng) 梁黎黎 張惠文 王瑞芳 楊 奕 孫宇寧 韓連書 余永國(guó) 邱文娟

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所 兒內(nèi)分泌遺傳代謝科（上海 200092）

糖尿病是以血糖升高為基本特征，由環(huán)境、遺傳及自身易感等多種因素共同參與造成的一組胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足的疾病，是威脅兒童身心健康的慢性疾病之一。兒童期糖尿病主要分為1 型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus，T1DM）、2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）及特殊類型糖尿病[1]。三種糖尿病臨床表現(xiàn)可有重疊容易被誤診[2]，影響糖尿病的治療方案選擇、長(zhǎng)期預(yù)后判斷及遺傳咨詢，因此對(duì)糖尿病作出準(zhǔn)確的分型及病因診斷具有重要的意義。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，二代測(cè)序在探尋分子遺傳學(xué)病因中發(fā)揮了巨大優(yōu)勢(shì)，但既往多為應(yīng)用基因靶向測(cè)序技術(shù)研究特殊類型糖尿病[3-4]，應(yīng)用全外顯子測(cè)序（whole exome sequencing，WES）技術(shù)全面探尋糖尿病分子遺傳學(xué)病因的研究較少。本研究對(duì)疑似單基因糖尿病患兒行WES 以明確該疾病的臨床特點(diǎn)及分子遺傳學(xué)病因。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性分析2020 年8 月至2021 年12 月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院兒內(nèi)分泌遺傳代謝科確診的76 例糖尿病患兒的臨床資料。所有患兒符合糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。本研究獲上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（No.XHEC-D-2022-027）。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集納入患兒的人口學(xué)資料、起病年齡、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、臨床表現(xiàn)等資料。

1.2.2 常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查 包括初診時(shí)血糖、C 肽、胰島素、糖化血紅蛋白（HbA 1 c）、胰島自身抗體（GADA、IAA、IAB、IA-2A、ZnT8A）等實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。1.2.3 全外顯子高通量測(cè)序（whole exome sequencing，WES）WES 檢測(cè)的入組標(biāo)準(zhǔn)：①家族中有高血糖或糖尿病史；②6 月齡前發(fā)??；③合并有胰腺外癥狀，包括肝酶持續(xù)升高、智力低下等臨床表型；④輕度非進(jìn)展的高血糖?；純悍仙鲜? 個(gè)條件之一者行全外顯子高通量測(cè)序[5]。首先提取患兒及父母外周血DNA，經(jīng)DNA 片段打碎、捕獲、富集及建庫(kù)等步驟之后利用Illumina HiSeq 4000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，篩選出可疑變異，查閱該變異在1000 Genomes Project、Genome Aggregation Database（GnomAD）和Exome Variant Server（EVS）等數(shù)據(jù)庫(kù)中正常人群的分布頻率，利用SIFT、PolyPhen 2及Variant Taster 等在線軟件分析蛋白功能危害性，根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)和指南（American college of medical genetics，ACMG）對(duì)所發(fā)現(xiàn)的變異進(jìn)行致病性評(píng)級(jí)，對(duì)可疑變異進(jìn)行患兒及父母來源的Sanger測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；非正態(tài)分布的以中位數(shù)（P25～P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WES檢測(cè)結(jié)果

76 例患兒中符合WES 檢測(cè)入組條件的有21例。經(jīng)WES 檢測(cè)，9 例發(fā)現(xiàn)遺傳性致病病因，其中7 例為單基因糖尿病（表1），且均為青少年的成人起病型糖尿病（maturity-onset diabetes of the young，MODY）；2 例為糖尿病合并其他遺傳性致病病因（1例合并18p缺失綜合征，1例合并Wilson?。?。

表1 7例MODY患兒全外顯子測(cè)序結(jié)果

7 例MODY 共有3 個(gè)基因受累：3 例為GCK變異所致的MODY 2、3 例為HNF 1 A變異所致的MODY 3，1 例為INS變異所致的MODY 10。7 例MODY 患兒中除INS變異為新發(fā)變異外，其他6 例所攜帶變異均來自患有糖尿病的父親或母親。共發(fā)現(xiàn)了2個(gè)未報(bào)道的MODY相關(guān)新變異，分別為GCK基因的c.1124T＞G(p.V375G)和INS基因的c.110A＞T(p.E 37 V)，依據(jù)ACMG 評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)均為致病性變異。

2.2 患兒臨床特點(diǎn)及初診時(shí)實(shí)驗(yàn)室檢查

76 例DM 患兒分為MODY 組7 例、T 2 DM 組7例和T 1 DM 組62 例。三組之間年齡、BMI，初診時(shí)空腹血糖、C肽、胰島素、HbA1c差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MODY組血糖及HbA1c較T1DM組低；C 肽水平較T 1 DM 組高，較T 2 DM 組低；胰島素水平低于T1DM組和T2DM組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。T2DM及MODY組患兒的胰島自身抗體均為陰性。

表2 不同型糖尿病患兒臨床資料比較[M(P25～P75)，()]

表2 不同型糖尿病患兒臨床資料比較[M(P25～P75)，()]

注：1)與T1DM組比較，P＜0.05；2)與T2DM組比較，P＜0.05

7 例MODY 患兒中5 例起病時(shí)無典型糖尿病癥狀，以偶然發(fā)現(xiàn)的血糖升高入院，2例表現(xiàn)為糖尿病“三多一少”癥狀，但無糖尿病酮癥酸中毒表現(xiàn)。7例患兒的父親或母親均有一方為糖尿病患者。

T 1 DM 患兒中1 例臨床表現(xiàn)有弓形眉和招風(fēng)耳等特殊面容及智力低下，WES 檢測(cè)提示染色體18p11.32-p11.21存在14 963kb缺失，該缺失包含與糖尿病表型無關(guān)的57個(gè)OMIM基因，后經(jīng)全基因組芯片檢測(cè)驗(yàn)證為18 p 缺失綜合征。1 例T 2 DM 患兒因合并肝功能異常及銅藍(lán)蛋白降低，WES檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其攜帶ATP7B基因的c.3089G＞A（p.Gly1030Asp）和c.1592A＞G（p.Lys531Arg）復(fù)合雜合變異，提示其合并Wilson病。

3 討論

單基因糖尿病是糖尿病的罕見類型，多由影響胰島β 細(xì)胞發(fā)育、功能或作用的單基因變異所致，多起病隱匿。隨著WES 的廣泛應(yīng)用，越來越多的單基因糖尿病被早期診斷[6]。相關(guān)研究應(yīng)用MODY相關(guān)基因靶向測(cè)序技術(shù)對(duì)胰島自身抗體陰性的82 例T1DM患者進(jìn)行檢測(cè)，確診18例（22.0%）單基因糖尿病[7]，另一項(xiàng)應(yīng)用WES 對(duì)60 例非T 1 DM 患者的研究發(fā)現(xiàn)，24例（40.0%）確診為單基因糖尿病[3]。本研究對(duì)21 例疑診為單基因糖尿病患兒應(yīng)用WES探尋其遺傳學(xué)病因，7例診斷為單基因糖尿病，且均為MODY。

MODY是最常見的單基因糖尿病[8]。該病是常染色體顯性遺傳，通常在25歲前發(fā)病，表現(xiàn)為β細(xì)胞功能或分泌障礙。MODY 的亞型疾病譜因不同地域而有所差別，歐美患者中以HNF1A變異最常見[8]，亞洲人群中GCK-MODY最常見[9]。無明顯糖尿病癥狀被認(rèn)為是GCK-MODY的主要特征，本研究中3例患兒為GCK-MODY，2例為偶然發(fā)現(xiàn)血糖偏高，1例攜帶c.562G＞A變異患兒有糖尿病“三多一少”癥狀。c.562 G＞A 變異攜帶者的臨床表現(xiàn)有較強(qiáng)異質(zhì)性，從無癥狀到典型糖尿病癥狀均有報(bào)道[10]。目前已有600余例GCK-MODY被報(bào)道，未發(fā)現(xiàn)熱點(diǎn)變異[11]。GCK-MODY患者通常無遠(yuǎn)期糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，除了孕期需要藥物治療外，僅需飲食控制和運(yùn)動(dòng)干預(yù)即可[12]。本組患兒診斷明確后僅給予飲食控制和運(yùn)動(dòng)干預(yù)后血糖得到良好控制，避免了過度治療。

MODY 3 是由肝細(xì)胞核因子HNF 1 A基因變異引起，臨床上可表現(xiàn)為餐后血糖升高，但僅少部分患者有典型糖尿病癥狀。文獻(xiàn)提示此類患兒疾病初始常需低劑量磺脲類藥物治療，隨著病情進(jìn)展患者胰島β 功能可能逐漸變差[13]。本研究中兩例患兒為偶然發(fā)現(xiàn)血糖偏高，1 例患兒因反復(fù)尿路感染發(fā)現(xiàn)高血糖。3例患兒診斷明確后調(diào)整為磺脲類藥物，血糖控制較前明顯好轉(zhuǎn)。3例患兒攜帶的HNF1A致病變異均為已報(bào)道變異，其中1 例患兒攜帶無義變異c.685C＞T(p.R229*)，以往研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄提前終止或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)異常的無義變異或移碼變異患者，比錯(cuò)義變異患者需要胰島素治療的概率大[13]，該患者要告知預(yù)后加強(qiáng)隨訪。

MOD10是由胰島素基因INS變異造成的。INSMODY 患者的臨床表現(xiàn)呈現(xiàn)明顯異質(zhì)性，無癥狀到合并有酮癥酸中毒均有報(bào)道[14-15]。本研究中攜帶INS變異的患兒7.5歲時(shí)出現(xiàn)糖尿病“三多一少”癥狀，但未發(fā)生酮癥酸中毒。該變異既往未見報(bào)道，經(jīng)ACMG 評(píng)級(jí)為致病性變異，結(jié)合患兒臨床表現(xiàn)及初診時(shí)實(shí)驗(yàn)室檢查可確診。該患兒雖然是單基因糖尿病，但由于病因系胰島素基因缺陷所致的胰島素缺乏，故應(yīng)該終身給予胰島素注射治療。目前已有MODY10患者眼底、神經(jīng)及腎臟病變相關(guān)并發(fā)癥報(bào)道[14-16]，提示應(yīng)對(duì)該病的長(zhǎng)期隨訪予以足夠重視。

全外顯子測(cè)序不僅有助于評(píng)估糖尿病病因，而且有助于解釋糖尿病外的臨床表現(xiàn)。1 例T 1 DM患兒表現(xiàn)為高血糖及智力低下，行WES 后發(fā)現(xiàn)18p11.32-p11.21存在14 963kb缺失，故診斷18p缺失綜合征，從而對(duì)智力低下做出臨床解釋。1 例T2DM肥胖患兒（BMI 25.1kg/m2）因持續(xù)肝功能異常就診發(fā)現(xiàn)高血糖，雖然肥胖患兒常合并肝功能損害，但由于該患兒銅藍(lán)蛋白及血銅氧化酶均降低，提示有可能為Wilson ??；WES 提示患兒攜帶ATP 7 B基因復(fù)合雜合致病性變異，明確為Wilson 病，并進(jìn)行青霉胺治療。

總之，本研究對(duì)21例疑診為單基因糖尿病的患兒行WES，共檢出單基因糖尿?。ň鶠镸ODY）患兒7例，對(duì)1例智力發(fā)育落后的T1DM患兒行WES檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其合并18 p 缺失綜合征，對(duì)另1 例肝酶進(jìn)行性升高的T2DM患兒行WES檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其合并Wilson病，提示早期針對(duì)性進(jìn)行WES檢測(cè)有助于明確單基因糖尿病的診斷并可精準(zhǔn)指導(dǎo)患兒的治療和預(yù)后。本研究提示單基因糖尿病中以MODY常見，擴(kuò)展了MODY 的基因變異譜，同時(shí)建議當(dāng)糖尿病伴發(fā)胰腺外表現(xiàn)時(shí)，需考慮其他遺傳性疾病的診斷。