利用RNA-seq 技術篩選火毛撒壩豬和杜洛克豬背最長肌差異基因

李再磊，竇必成，趙玉香，邱丙姍，吳正明，翁亞煩，孫婷婷，趙桂英*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，云南昆明 650201；2.云南楚雄南華縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，云南楚雄 675200）

我國地方豬種資源是養(yǎng)豬生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的基礎，近年來隨著組學技術的不斷發(fā)展，地方豬種資源的保護及開發(fā)利用越來越受到重視。大多數(shù)云南地方豬具有適應性強和肉質好等特性，李志勛等對火毛撒壩豬、高黎貢山豬和杜洛克豬生產(chǎn)性能的比較研究發(fā)現(xiàn)，火毛撒壩豬的熟肉率極顯著高于杜洛克豬，貯存損失極顯著低于杜洛克豬；火毛撤壩豬的背最長肌、股二頭肌肌纖維直徑顯著高于杜洛克豬；火毛撒壩豬肌肉的膽固醇含量極顯著低于高黎貢山豬和杜洛克豬。應用RNA-seq技術研究調控中國地方豬優(yōu)質性狀的分子機制對豬肉質性能測定的研究已有很多，但針對杜洛克豬和撒壩豬的背最長肌差異基因研究與篩選、火毛撒壩豬優(yōu)良肉質性狀遺傳機制的研究未見報道。本研究通過RNA-seq技術對杜洛克豬與火毛撒壩豬之間的差異表達基因進行篩選與注釋，分析2 個豬種之間肉質遺傳機制的差異，尋找差異表達基因及信號通路，確定調控肉質性狀的關鍵基因，為探究云南特有地方豬種與優(yōu)良外來豬種的差異以及對云南地方豬的發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 選用10 頭70 日齡胎次和產(chǎn)仔日齡相近的火毛撒壩豬和杜洛克豬，相同條件下飼養(yǎng)至260 日齡，隨機屠宰各4 頭。采集背最長肌樣品，同一豬種4 頭豬樣品混成1 份進行總RNA 提取，采用天根生化科技（北京）有限公司RNA 提取試劑盒（DP419），用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA，Agilent 2100 RNA 6000 Nano Kit 進行濃度精確定量，將檢測合格的樣品進行轉錄組測序。

1.2 實驗方法 測序reads 的比對及基因表達量統(tǒng)計：利用STAR 軟件（版本2.5.3a）將火毛撒壩豬和杜洛克豬獲得的干凈讀數(shù)比對到參考基因組Sus scrofa 11.1（ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-99/variation/gvf/sus_scrofa/）上，得到全面的轉錄本信息，并統(tǒng)計比對結果。再通過featureCounts（Subread-1.5.1，Bioconductor）對映射到每個基因外顯子區(qū)域的讀數(shù)進行計數(shù)，然后計算RPKM（Reads per Kilobase per Million Reads）值，即每一百萬個比對上基因組的讀段中比對到轉錄本的每一千個堿基上的讀段個數(shù)，作為基因表達量的衡量指標。

基因差異表達分析：差異表達基因是指樣品間上調表達基因和下調表達基因的匯總。本研究使用edgeR 軟件（版本3.12.1）分析基因在各樣本中的差異表達情況，差異基因通過篩選閾值|logFC|≥1 且錯誤發(fā)現(xiàn)率（False Discovery Rate，F(xiàn)DR）≤0.05 為表達量顯著差異的基因。差異表達基因的GO 富集分析：利用GO 數(shù)據(jù)庫（Gene Ontology,http://www.geneontology.org）將基因按照其參與的生物過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）及細胞組分（Cellular Component，CC）3 個方面進行分類注釋。通過GO term 注釋的差異基因，計算每個term 的基因列表和基因數(shù)目，應用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，差異表達基因中顯著富集的GO 條目，從而找出差異表達基因顯著相關的生物學功能，＜0.05 時，該條目作為顯著條目。

差異表達基因的KEGG 富集分析：KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫（http://www.genome.jp/kegg/），即京都基因和基因組百科全書，是通路分析的主要數(shù)據(jù)庫。利用KOBAS 軟件對差異表達的基因進行通路分析，找出與整個基因組背景相比FDR＜0.05 的通路為差異表達基因顯著富集的通路，其中FDR 值是校正后的值。

2 結果與分析

2.1 總RNA 質量 提取2 個豬種背最長肌組織的RNA，檢測濃度，總RNA 的濃度均大于40 ng/μL（杜洛克豬150 ng/μL、火毛撒壩豬139.5 ng/μL），OD值均處于1.8～2.2，結果說明實驗提取的總RNA 質量高可以用來測序。

2.2 測序數(shù)據(jù)質控及比對情況 使用Illumina HiSeq 平臺進行測序，結果顯示火毛撒壩豬和杜洛克豬背最長肌總reads 讀取數(shù)分別為130 567 646 條、85 043 169 條，clean reads 分別為95 362 436.5、82 899 945.6，有 效讀數(shù)率為74.8%、97.4%；Q30 低于0.1% 的為99.1%和92.5%，GC 堿基含量分別為50.6% 和54.1%；約95.81%的過濾后序列被定位到杜洛克豬的參考基因組，低于撒壩豬的97.13%（表1）。

表1 測序數(shù)據(jù)在參考基因組上的比對情況

2.3 差異表達基因篩選 本研究只對2 個豬種間差異顯著的基因進行分析。在火毛撒壩豬中上調的基因，在杜洛克豬中是下調的，反之亦然。2 個豬種間共篩選出3 683 個差異顯著表達基因，火毛撒壩豬與杜洛克豬相比，有1 516 個上調基因，2 167 個下調基因，其中火毛撒壩豬主要的上調基因有和等，下調基因有等（表2、圖1）。

表2 富集于GO 和KEGG 通路內與脂肪相關的5 個相關基因

圖1 火毛撒壩豬背最長肌組織差異表達基因篩選情況

2.4 GO 功能富集分析 火毛撒壩豬與杜洛克豬背最長肌上調差異表達基因中顯著富集的GO 條目共有297 個，最顯著的前20 個GO 條目如表3 所示。生物過程主要顯著性富集在電子傳遞鏈、呼吸電子傳遞鏈、mRNA加工等條目；分子功能（MF）主要顯著富集在RNA 結合等條目；細胞組分（CC）主要顯著性富集在呼吸鏈、線粒體、核糖核蛋白復合物、細胞內細胞器部分等條目。

表3 火毛撒壩豬背最長肌上調差異表達基因顯著富集的條目

對火毛撒壩豬與杜洛克豬的差異表達基因富集的條目分析，背最長肌下調差異表達基因中顯著富集的GO條目共有217 個，最顯著的前20 個GO 條目如表4 所示。生物過程主要顯著性富集在細胞對生物刺激的反應、響應DNA 損傷的信號轉導、細胞分解代謝過程的負調節(jié)、蛋白質分解代謝過程的負調節(jié)等條目；分子功能（MF）主要顯著富集在核糖體的結構成分、結構分子活性、酶結合、GTP 酶結合等條目；細胞組分（CC）主要顯著性富集在胞質部分、胞質核糖體、核糖體亞基、胞質大核糖體亞基、胞質小核糖體亞基等條目。

表4 火毛撒壩豬背最長肌下調差異表達基因顯著富集的條目

2.5 KEGG 富集分析 如表5、6 所示，上、下調差異表達基因顯著富集的通路分別為23 條、25 條，共48 條。在火毛撒壩豬背最長肌組織中，上調基因參與的23 條代謝通路中主要的代謝通路有mRNA 監(jiān)測途徑、脂肪酸代謝等。而下調差異表達基因參與的25 條生物學代謝通路中，主要的代謝通路有6 條與脂類代謝相關的通路，分別是脂肪酸代謝、PPAR 信號通路、不飽和脂肪酸的生物合成、脂肪酸降解、脂肪酸延長、甘油磷脂代謝。與疾病相關的通路，分別是金黃色葡萄球菌感染、利什曼病、核糖體、病毒性心肌炎、B 細胞受體信號通路、哮喘、用于IgA 生成的腸道免疫網(wǎng)絡等。

表5 火毛撒壩豬背最長肌上調差異表達基因顯著富集的通路

3 討 論

本研究以GO 和KEGG 2 大數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)資源為基礎，對其進行了通路分析，有48 條顯著富集通路，其中有6 條與脂類代謝相關。大部分通路內富集有關脂肪酸代謝、沉積的基因，其中和ACAD 這5 個與脂肪沉積、代謝和脂肪細胞分化相關的基因均上調。

表6 火毛撒壩豬背最長肌下調差異表達基因顯著富集的通路

對火毛撒壩豬與杜洛克豬背最長肌的差異表達基因進行GO 功能富集分析，上、下調差異表達基因中，生物過程富集到的GO 條目最多。由此可以得出，生物過程是火毛撒壩豬、杜洛克豬在背最長肌中差異表達基因行使的主要生物學功能。通過GO 生物學功能和KEGG 通路富集分析表明，基因產(chǎn)物主要涉及IRS1/Akt/FoxO1 信號通路、腺苷50-單磷酸激活蛋白激酶（AMPK）的級聯(lián)作用、脂質代謝和氨基酸代謝途徑，這些途徑有助于民豬的脂肪酸代謝、肌內脂肪沉積和骨骼肌生長。通過對葡萄牙阿連特雅諾（Alentejano，AL）和比薩羅（Bísaro，BI）本地豬種的脂肪組織進行轉錄組分析，結果表明共鑒定出458 個差異表達的基因，AL 中較高脂肪沉積的決定因素與脂肪酸從頭合成的增加有關，這正是由于和等關鍵基因的上調所導致的；此外通路分析表明通過和，使得AL 中膽固醇合成提高。使用RNA-seq 對豬的肝臟組織進行轉錄組測序，結果鑒定出等55 個差異表達基因，這些基因屬于與脂質和脂肪酸代謝有關的經(jīng)典途徑和基因網(wǎng)絡。本研究在火毛撒壩豬和杜洛克豬中均未富集到膽固醇合成代謝直接相關的功能條目，但富集到了脂肪酰乙酰輔酶A 生物合成過程、?；o酶A 脫氫酶活性、基輔酶A 結合、脂肪酸-氧化、脂質氧化、細胞脂質分解代謝過程等與脂代謝相關的GO 條目，這些結果與前人研究結果相似。脂肪酸能夠對膽固醇的代謝產(chǎn)生影響，單不飽和脂肪酸可誘導膽固醇酯化進而維持機體膽固醇在較低水平，其中棕櫚油酸（C16:1）和油酸（C18:1）是膽固醇酯中含量最高的脂肪酸，對肌肉脂質沉積等有著重要作用。而乙酰輔酶A 是含有NADPH 的非脂質前體，是膽固醇從頭生物合成的底物，與膽固醇關系密切。由此可見，以上這些GO 條目可能在火毛撒壩豬低膽固醇形成的分子機制中具有重要的功能。

KEGG 數(shù)據(jù)庫中豐富的通路信息有助于去了解基因的生物學功能，如代謝途徑、遺傳信息傳遞以及細胞過程等一些復雜的生物功能。差異表達基因進行KEGG通路富集分析，在火毛撒壩豬的上調差異表達基因中均富集到了與脂類代謝相關的PPAR 信號通路，說明火毛撒壩豬與杜洛克豬在脂類代謝方面的差異可能是由于PPAR 信號通路的一些相關基因表達差異引起的，這與楊建敏研究杜洛克豬與槐豬的背最長肌轉錄組分析結果相似。

對PPAR 信號通路進行分析，和這5 個與脂肪的沉積、代謝和脂肪細胞分化的相關基因均上調，且這些基因的表達量均是火毛撒壩豬高于杜洛克豬。李優(yōu)磊等對調控豬皮下脂肪與肌內脂肪差異沉積中PPAR 信號通路的作用進行研究，結果顯示富集指數(shù)是PPAR 信號通路最高。長鏈脂酰輔酶A 合成酶（）是生物合成途徑中不可或缺的。對脂肪細胞分化關鍵轉錄因子的活性起到調節(jié)的長鏈脂酰輔酶A 合成酶3（）參與脂肪酸的吸收。Bu 等使用RNA 干擾技術抑制大鼠原代肝臟細胞基因的表達，結果顯示基因顯著降低了等脂肪生成相關的轉錄因子的活性。在單不飽和脂肪酸（MUFA）的形成中，硬脂酰輔酶A 去飽和酶（）會限制其速度?，F(xiàn)有研究顯示有2 個亞型，其中主要在脂肪組織中表達，主要在腦組織中表達，但在腦外組織的功能尚未闡明。陶璇等采用熒光定量PCR（qRT-PCR）方法檢測在藏豬和杜洛克豬里脊中關于IMF 沉積相關基因的表達差異，結果表明：180日齡的藏豬mRNA 表達量極顯著高于杜洛克豬?；鹈鰤呜i背最長肌中基因表達量也高于杜洛克豬，在脂肪沉積能力較強的豬種上基因均顯著富集，說明基因可能是調控豬脂肪沉積的重要候選基因。脂肪酸結合蛋白（）家族的過表達會增加脂肪酸的轉運。為肝臟型脂肪酸結合蛋白，Bamester 等對34 頭豬的肝臟組織做共表達網(wǎng)絡和表達基因組全關聯(lián)分析，鑒定豬肉品質性狀功能調控機制中涉及的DNA 變異和分子途徑，通過DNA 變異與基因多重相互作用發(fā)現(xiàn)基因可能決定背膘中C18:2（n-6）脂肪酸與C18:3（n-3）的比例；FABP4為脂肪性脂肪酸結合蛋白，陳滇黔等在研究山羊肉質相關主效基因時得到FABP4 為其影響肉質的主效基因。李寶鈞等研究發(fā)現(xiàn)在綿羊脂肪組織中的mRNA 表達最高，與其他組織差異顯著。脂肪酸結合蛋白7（）位于PPAR 通路中，在細胞生長分化、脂質代謝過程中發(fā)揮作用。在本實驗中顯著富集的通路中大多篩選出脂肪酸結合蛋白（）家族的基因，且均在火毛撒壩豬中有較高表達，與以往的研究一致。乙酰輔酶A 脫氫酶（）家族催化脂肪酸氧化，長鏈輔酶A 脫氫酶（）在長鏈脂肪酸-氧化中起著表達調控和活性調節(jié)的作用。喬木等對長白豬、大約克夏豬和梅山豬進行基因分型和脂肪沉積性狀關聯(lián)分析，得出基因與6～7 腰椎間膘厚、肩臀膘厚和背最長肌肌內脂肪含量存在顯著相關（＜0.05）的結論。戢爽研究顯示延黃牛和延邊黃牛的脂肪組織和背最長肌中基因表達差異不顯著。以上結果提示PPAR 信號通路可能是火毛撒壩豬脂肪沉積能力的關鍵通路。

火毛撒壩豬下調差異表達基因主要富集在以下幾個通路：利什曼病、病毒性心肌炎、哮喘、用于IgA 生成的腸道免疫網(wǎng)絡等，這些通路與疾病相關，說明火毛撒壩豬具有較好的抗病力，該結果為地方豬抗病育種研究提供了方向。

4 結 論

本次研究利用RNA-seq 技術對火毛撒壩豬和杜洛克豬背最長肌的轉錄組進行測序分析，揭示了撒壩豬和杜洛克豬背最長肌的整體表達特征，共篩選出3 683 個差異基因?；鹈鰤呜i和杜洛克豬相比，有1 516 個上調基因，2 167 個下調基因。本研究找出了與肉質性狀顯著相關的脂類代謝等代謝通路，同時發(fā)現(xiàn)與金黃色葡萄球菌感染、利什曼病有關的生物學通路其差異表達基因下調，說明火毛撒壩豬具有更強的抗病力。