中國(guó)草原紅牛MED4 基因第7 外顯子多態(tài)性與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性研究

魏銘宏，吳思惠，呂香州，曹 陽(yáng)，于永生，吳 健,3,4,5，高青山，趙玉民,3,4,5*

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延邊 133002；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，吉林公主嶺 136100；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉牛遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林公主嶺 136100；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北種牛性能測(cè)定中心，吉林公主嶺 136100；5.吉林省肉牛繁育及養(yǎng)殖技術(shù)科技創(chuàng)新中心，吉林長(zhǎng)春 130033）

中國(guó)草原紅牛是通過(guò)英國(guó)短角牛與本地牛的級(jí)進(jìn)雜交、橫交固定和自群繁育提高等3 個(gè)階段培育而成的第一種肉乳兼用型新品種，具有增重速度快、耐粗飼、肉質(zhì)鮮嫩、肌間脂肪沉積良好、可以適應(yīng)北方寒冷的氣候條件等優(yōu)良特性，其屠宰率和凈肉率分別可達(dá)到56.5%和43.9%，大理石花紋等級(jí)平均為5 級(jí)，在國(guó)內(nèi)屬于優(yōu)秀肉牛。

是介體復(fù)合物的一個(gè)亞基，也被稱(chēng)作等。介體是一種多蛋白轉(zhuǎn)錄共激活因子，其復(fù)合物共包括30 多種亞基（）。作為DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)RNA 聚合酶II（Pol II）轉(zhuǎn)錄所必需的因子，在酵母和哺乳動(dòng)物等的真核生物中普遍表達(dá)。同時(shí)介體復(fù)合物還可以與許多輔助激活因子和輔助抑制因子相互作用，如可參與Srb10/Srb11（CDK8/CycC）所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制過(guò)程。

在介體復(fù)合物中，不僅可與PPAR、雌激素受體（ER）、甲狀腺激素受體（TR）和維生素D 受體（VDR）等以配體依賴(lài)的方式相互作用。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，還可影響肌肉纖維的類(lèi)型，在哺乳動(dòng)物脂代謝中起重要的調(diào)控作用。而表達(dá)量的降低可減少與啟動(dòng)子、增強(qiáng)子的結(jié)合，進(jìn)而影響Pol II與啟動(dòng)子的結(jié)合，從而降低的調(diào)節(jié)作用。

目前關(guān)于基因的研究多集中于酵母菌等真核生物以及人類(lèi)癌癥、腫瘤等疾病中，關(guān)于動(dòng)物肉質(zhì)性能等方面的研究鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)利用Sanger 測(cè)序法，以草原紅牛為研究對(duì)象，檢測(cè)基因第7 外顯子的多態(tài)性，分析其與草原紅牛肉質(zhì)性狀的相關(guān)性，為篩選影響中國(guó)草原紅牛肉質(zhì)性狀的候選基因提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取遺傳背景一致的118 頭中國(guó)草原紅牛（由吉林維多利農(nóng)牧業(yè)有限公司提供），統(tǒng)一飼養(yǎng)至20 月齡，集中屠宰，收集背最長(zhǎng)肌進(jìn)行肉質(zhì)分析，同時(shí)采集肝臟組織，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA 的提取 使用動(dòng)物組織DNA 提取試劑盒（北京solarbio 生物有限公司）提取118 頭草原紅牛肝組織基因組DNA，采用超微量分光光度計(jì)（Thermo Fisher公司）檢測(cè)提取的DNA 濃度與純度，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR 引物設(shè)計(jì)與合成 參考NCBI 中公布的?；駽DS 序列（登錄號(hào)：NM_001034486.1），通過(guò)Ensemble 網(wǎng)站查找基因第7 外顯子，使用Primer 5.0 設(shè)計(jì)外顯子引物，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。引物信息如下：F：5'-GGAAAGAA GAAGAAGTGAA-3'；R：5'-CTACCAAAGTTGGGAT TA-3'。擴(kuò)增片段939 bp，退火溫度51.5℃。

1.4 PCR 反應(yīng)體系及程序 PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：2×Taq Master Mix 10 μL（1×）（康為世紀(jì)生物科技公司），上下游引物（0.5 μmol/L）各0.5 μL，模板DNA（＜250 ng/50 μL）1 μL，ddHO 8 μL。

PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s、51.5℃ 30 s、72℃延伸1 min，34 個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min。產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆?。PCR 儀由上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)。

1.5 草原紅牛基因SNPs 檢測(cè) 對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將符合預(yù)期大小的PCR 產(chǎn)物送金唯智生物公司進(jìn)行Sanger 測(cè)序。使用DNAMAN、Chromas 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)，分析堿基變化情況并篩選SNP 位點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)基因型及基因型頻率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Excel 2010 計(jì)算基因（型）頻率、Hardy-Weinberg 的卡方適合性檢測(cè)、遺傳純合度（Ho）、遺傳雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）和多態(tài)信息含量（PIC）。公式如下：

其中，公式中n 為等位基因數(shù)；p、p表示為第個(gè)等位基因頻率。

通過(guò)SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，分析SNP 位點(diǎn)的不同基因型與肉用性狀的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，＜0.05 為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 草原紅牛基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)片段長(zhǎng)度與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致（圖1），且得到的擴(kuò)增條帶清晰明亮無(wú)雜帶，可用于測(cè)序。

圖1 MED4 基因第7 外顯子PCR 產(chǎn)物電泳圖

2.2 序列分析 利用DNAMAN、Chromas 等軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果以及測(cè)序峰圖進(jìn)行比對(duì)，確定基因第7 外顯子在A268G 以及A420G 處發(fā)生A/G 突變（圖2～4），其中A268G 突變導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變，由甘氨酸（Gly）變?yōu)榻z氨酸（Ser），而A420G 突變未導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變（圖5）。

圖2 草原紅牛MED4 基因第7 外顯子序列對(duì)比

圖3 A268G 處基因型測(cè)序峰圖

圖4 A420G 處基因型測(cè)序峰圖

圖5 MED4 基因第7 外顯子氨基酸比對(duì)（7：第7 外顯子原始序列）

2.3 草原紅牛基因遺傳學(xué)分析 對(duì)草原紅?；虻? 外顯子基因（型）頻率等指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算（表1～2），結(jié)果顯示，A268G 處以及A420G 處GG基因型均為優(yōu)勢(shì)基因型，G 為優(yōu)勢(shì)基因，2 個(gè)位點(diǎn)Ho較高，He 較低，0.25＜PIC＜0.5，均處于中度多態(tài)；且經(jīng)卡方檢驗(yàn)并對(duì)照臨界值表得到值范圍，二者均處于Hardy-Weinberg 不平衡狀態(tài)。

表1 草原紅牛MED4 基因第7 外顯子基因（型）頻率

2.4基因第7 外顯子不同基因型肉用性狀相關(guān)性分析結(jié)果顯示，基因第7 外顯子A268G 位點(diǎn)與肉用性狀無(wú)顯著相關(guān)，A420G 位點(diǎn)與肉嫩度、pH、L值以及蛋白質(zhì)含量差異顯著（表3），GG 型個(gè)體嫩度、pH 顯著低于GA 型個(gè)體，蛋白含量顯著高于AA 型個(gè)體，但肉色L 值顯著高于GA 型個(gè)體。

表2 草原紅牛MED4 基因遺傳變異參數(shù)

表3 MED4 基因第7 外顯子A420G 處不同基因型與肉用性狀相關(guān)性分析

3 討 論

介體復(fù)合物是一種多蛋白復(fù)合物，是其中的一種亞基。介體可通過(guò)將激活物和抑制物結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子（TFs）與起始前復(fù)合物（PIC）連接，將RNA 聚合酶II（Pol II）招募到特定的基因啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)錄。在結(jié)構(gòu)分類(lèi)的基礎(chǔ)上，介體復(fù)合物可分為頭、中、尾3個(gè)模塊，每個(gè)模塊都由不同的亞基組成，這些不同亞基決定了不同模塊在轉(zhuǎn)錄中起到的不同作用。目前許多亞基已被發(fā)現(xiàn)在生物發(fā)育、激素信號(hào)、脂肪合成等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。是介體復(fù)合物中間模塊的組成部分，可與相互作用。在禽類(lèi)體內(nèi)，已被發(fā)現(xiàn)可調(diào)控禽類(lèi)的生長(zhǎng)與胴體性狀。也有研究發(fā)現(xiàn)可作為影響禽類(lèi)肌內(nèi)脂肪（IMF）沉積的候選基因。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Sanger 測(cè)序法對(duì)草原紅?；蜻M(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)篩選，發(fā)現(xiàn)在其第7 外顯子存在2 處突變位點(diǎn)，其中A268G 處存在A/G 同義突變，A420G 處存在A/G 錯(cuò)義突變，由甘氨酸（Gly）變?yōu)榻z氨酸（Ser）。2 處突變均存在GG、GA、AA 3 種基因型，GG 型為優(yōu)勢(shì)基因型，G 為優(yōu)勢(shì)基因，PIC 屬于中度多態(tài)，卡方檢驗(yàn)樣本均處于Hardy-Weinberg 不平衡狀態(tài)。

基因第7 外顯子A268G 處不同基因型的肉用性狀無(wú)顯著差異；A420G 處不同基因型的蛋白質(zhì)含量、肉嫩度、pH 以及L 值存在顯著差異，GG 型個(gè)體A420G 處、肉嫩度顯著高于GA 型與AA 型個(gè)體，pH顯著低于GA 型個(gè)體，但蛋白含量顯著低于AA 型個(gè)體。因此在利用遺傳標(biāo)記選擇中需要根據(jù)不同需求權(quán)衡基因型個(gè)體。

本研究通過(guò)對(duì)草原紅?；騍NPs 進(jìn)行檢測(cè)及其與草原紅牛肉質(zhì)性狀進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)草原紅?；虻? 外顯子A420G 處的突變可影響牛肉的嫩度、pH、蛋白質(zhì)含量等肉質(zhì)性狀，為畜產(chǎn)品品質(zhì)研究方面提供了參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)草原紅?；虻牡? 外顯子進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在A268G 處存在A/G 錯(cuò)義突變，在A420G 處存在A/G 同義突變，2 處多態(tài)性位點(diǎn)在抽查群體中均處于Hardy -Weinberg 不平衡狀態(tài)，屬于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5）；第7 外顯子在A420G 處不同基因型的蛋白質(zhì)含量、肉嫩度、pH 以及L 值存在顯著差異。