綿羊BMP2、BMP4 和BMP7 基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

孟 科，榮 軒，梁 鵬，強(qiáng) 浩，馮登偵

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021）

我國(guó)養(yǎng)殖的大多數(shù)綿羊都為單羔品種，生產(chǎn)時(shí)出現(xiàn)雙羔以及多羔的情況比較少，篩選綿羊的多胎基因可以顯著提高其繁殖力，有利于提高養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益。綿羊多羔性狀是綿羊育種和生產(chǎn)中的一個(gè)重要繁殖性狀，受到遺傳、飼養(yǎng)環(huán)境、激素、營(yíng)養(yǎng)等多因素的綜合影響。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，綿羊多羔性狀的候選基因已被眾多學(xué)者進(jìn)行了深入研究，大多集中在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（Transforming Growth Factor-，-）超家族和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphogenetic Protein，）通路或與之相關(guān)的信號(hào)通路。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（）屬于-超家族的一員，該蛋白大約有20 多個(gè)家族成員，其成員在結(jié)構(gòu)上相似，但其功能在不同時(shí)期和不同階段有著很大的區(qū)別。與哺乳動(dòng)物的多種功能密切相關(guān)，該蛋白不僅可誘導(dǎo)軟骨和骨的形成，而且對(duì)于調(diào)節(jié)動(dòng)物繁殖、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡具有非常重要的作用。、和基因是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族的重要成員。據(jù)研究表明，在體外培養(yǎng)的牛卵泡中，10 ng/mL的可促進(jìn)原始卵泡的發(fā)育并維持次級(jí)卵泡的超微結(jié)構(gòu)，100 ng/mL 的可促進(jìn)原始卵泡、次級(jí)卵泡和卵母細(xì)胞的直徑增加。Kumar 等研究發(fā)現(xiàn)，在水牛妊娠的不同階段，基因mRNA 和的表達(dá)量在妊娠早期均顯著上升，基因mRNA 表達(dá)量在妊娠晚期也明顯上升。Tanwar 等研究發(fā)現(xiàn)，基因及其下游靶蛋白（pSMAD1/5/8）在小鼠卵泡發(fā)育的各個(gè)階段均有表達(dá)。還有研究結(jié)果表明，小鼠敲除基因后，將導(dǎo)致子宮缺陷甚至生育能力降低。這些研究均說(shuō)明、和基因在動(dòng)物繁殖方面起著關(guān)鍵作用。

本實(shí)驗(yàn)以杜泊羊、灘寒雜交羊、雜一代、雜二代和橫交一代5 個(gè)綿羊群體為研究對(duì)象，基于Ensemble 數(shù)據(jù)庫(kù)中查到的、和基因的錯(cuò)義突變位點(diǎn)（g.48462350C＞T、g.63454744T＞G、g.58171856C＞G），利用Sequenom MassARRAYSNP 技術(shù)對(duì)3 個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測(cè)，探究不同綿羊群體、和基因SNP 位點(diǎn)的多態(tài)性，并與產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，篩選影響5 個(gè)綿羊群體多羔性狀的關(guān)鍵位點(diǎn)，為上述綿羊群體產(chǎn)羔數(shù)的選育提供分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究的實(shí)驗(yàn)個(gè)體均來(lái)自寧夏宇泊科技有限公司石嘴山威震肉羊繁育場(chǎng)，各羊群信息如表1 所示。實(shí)驗(yàn)羊均為健康無(wú)病、飼養(yǎng)管理一致的成年母羊。將采集的耳組織放入75%酒精，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實(shí)驗(yàn)羊群信息

1.2 基因組DNA 提取 綿羊耳組織樣本使用組織DNA磁珠法提取試劑盒對(duì)DNA 進(jìn)行提取，-20℃保存，用于后續(xù)的飛行質(zhì)譜基因型檢測(cè)。

1.3 飛行質(zhì)譜檢測(cè) 采用Sequenom MassARRAYSNP 技術(shù)對(duì)768 只綿羊的、和基因3 個(gè)位點(diǎn)（rs號(hào)分別為rs160577278、rs416697440 和rs422626052）在5 個(gè)綿羊群體進(jìn)行基因型檢測(cè)，待檢樣品為DNA。該步驟交由北京康普森農(nóng)業(yè)科技有限公司完成，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下。①引物設(shè)計(jì)：根據(jù)Ensemble 數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的綿羊、和基因SNP 位點(diǎn)信息，使用Sequenom 公司的引物設(shè)計(jì)軟件Assay Design 3.1設(shè)計(jì)待測(cè)SNP 位點(diǎn)的PCR 反應(yīng)和單堿基延伸引物（表2）；②DNA 質(zhì)檢；③PCR 擴(kuò)增：該步驟在384 孔板中進(jìn)行，PCR 反應(yīng)體系：0.5 μL 的10×PCR Buffer，0.4 μL 的MgCl（（25 mmol/L），0.1 μL 的dNTP Mix（25 mmol/L），1 μL 的Primer Mix（0.5 μmol/L），0.2 μL 的HotStar Taq（5 U/μL），1.8 μL 的去離子水，1 μL 的10 ng/μL DNA，總 反應(yīng)體系為5 μL/ 孔。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性120 s，94 ℃變性20 s、56 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸60 s（45 個(gè)循環(huán)），72 ℃延伸180 s，4 ℃保存；④蝦堿性磷酸酶（Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP）消化；⑤單堿基延伸；⑥樹脂純化；⑦芯片點(diǎn)樣；⑧質(zhì)譜檢測(cè)。

表2 SNPs 位點(diǎn)引物信息表

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Excel 2019 軟件統(tǒng)計(jì)綿羊、和基因3 個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）和有效等位基因數(shù)（Ne），進(jìn)行哈代 -溫伯格平衡檢驗(yàn)。用SPSS 22.0 軟件程序中一般線性模型對(duì)5 個(gè)綿羊群體各基因型與產(chǎn)羔數(shù)表型數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 提取質(zhì)檢結(jié)果 利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)5 個(gè)綿羊群體耳組織DNA 的純度、濃度和完整性。DNA 提取質(zhì)檢結(jié)果顯示，單個(gè)樣品濃度都在50 ng/μL以上，OD/OD為1.7～2.1，無(wú)大分子污染；電泳條帶均單一、清晰（圖1）。

圖1 DNA 電泳圖

2.2、和基因分型結(jié)果 由圖2 可知，基因的g.48462350C＞T 位點(diǎn)存在CC、CT、TT 3 種基因型。結(jié)果表明，該位點(diǎn)的CT 基因型個(gè)體數(shù)最多，TT 基因型個(gè)體數(shù)較少?；虻膅.63454744T＞G位點(diǎn)存在GG、GT、TT 3 種基因型。結(jié)果表明，該位點(diǎn)的TT 基因型個(gè)體數(shù)最多，GG 基因型個(gè)體數(shù)較少?；虻膅.58171856C＞G 位點(diǎn)存在CC、GC、GG 3 種基因型。結(jié)果表明，該位點(diǎn)的CC 基因型個(gè)體數(shù)最多，GG 基因型個(gè)體數(shù)較少。

圖2 BMP2、BMP4 和BMP7 基因3 個(gè)位點(diǎn)的分型結(jié)果

2.3基因多態(tài)性分析及其與綿羊群體產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

2.3.1基因SNP 位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)分析基因的g.48462350C＞T 位點(diǎn)在5 個(gè)綿羊群體中均存在CC、TC、TT 3 種基因型；經(jīng)卡方適合性檢驗(yàn)分析，該位點(diǎn)在D 群體不處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)（＜0.05），在其他群體均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)（＞0.05）（表3）。該位點(diǎn)在5 個(gè)群體中均處于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5）（表4）。

表3 BMP2 基因頻率和基因型頻率

表4 BMP2 基因SNP 位點(diǎn)群體遺傳學(xué)分析

2.3.2基因與綿羊群體產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)性分析 對(duì)結(jié)果樣品進(jìn)行校正，對(duì)群體數(shù)量低于5% 的基因型淘汰后再對(duì)其他基因型進(jìn)行分析，然后對(duì)基因g.48462350C＞T 位點(diǎn)的不同基因型與5 個(gè)群體的產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明：該位點(diǎn)不同基因型與5 個(gè)綿羊群體的產(chǎn)羔數(shù)均無(wú)顯著差異，不適用于上述綿羊群體多羔性狀的選育（表5）。

表5 BMP2 基因在5 個(gè)綿羊群體中基因型與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

2.4基因多態(tài)性分析及其與綿羊群體產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

2.4.1基因SNP 位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)分析基因的g.63454744T＞G 位點(diǎn)在D、H群體中存在GT、TT 2 種基因型，在其他群體均存在GG、GT、TT 3 種基因型，該位點(diǎn)在5 個(gè)綿羊群體的優(yōu)勢(shì)基因型為TT，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)門；經(jīng)卡方適合性檢驗(yàn)分析，該位點(diǎn)在5 個(gè)群體均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)（＞0.05）（表6）。該位點(diǎn)在5 個(gè)群體中均表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC＜0.25）（表7）。

表6 BMP4 基因頻率和基因型頻率

表7 BMP4 基因SNP 位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)分析

2.4.2基因與綿羊群體產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)性分析 對(duì)結(jié)果樣品進(jìn)行校正，對(duì)群體數(shù)量低于5% 的基因型淘汰后再對(duì)其他基因型進(jìn)行分析，然后對(duì)基因g.63454744T＞G 位點(diǎn)的不同基因型與5 個(gè)群體的產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明：該位點(diǎn)不同基因型與5 個(gè)綿羊群體的產(chǎn)羔數(shù)均無(wú)顯著差異（＞0.05），不適用于上述綿羊群體多羔性狀的選育（表8）。

表8 BMP4 基因在5 個(gè)綿羊群體中基因型與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

2.5基因多態(tài)性分析及其與綿羊群體產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

2.5.1基因SNP 位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)分析基因的g.58171856C＞G 位點(diǎn)在D、TH 群體中存在CC、GC 2 種基因型，在其他群體均存在GG、GC、CC 3 種基因型，該位點(diǎn)在5 個(gè)綿羊群體的優(yōu)勢(shì)基因型為CC，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镃；經(jīng)卡方適合性檢驗(yàn)分析，該位點(diǎn)在5 個(gè)群體均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)（＞0.05）（表9）。該位點(diǎn)在5 個(gè)群體中均表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC＜0.25）（表10）。

表9 BMP7 基因頻率和基因型頻率

表10 BMP7 基因SNP 位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)分析

2.5.2基因與5 個(gè)綿羊群體產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)性分析對(duì)結(jié)果樣品進(jìn)行校正，對(duì)群體數(shù)量低于5% 的基因型淘汰后再對(duì)其他基因型進(jìn)行分析，然后對(duì)基因g.58171856C＞G 位點(diǎn)的不同基因型與5 個(gè)群體的產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明：該位點(diǎn)不同基因型均與5個(gè)綿羊群體的產(chǎn)羔數(shù)無(wú)顯著差異，不適用于上述綿羊群體多羔性狀的選育（表11）。

表11 BMP7 基因5 個(gè)綿羊群體中基因型與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

3.1基因與產(chǎn)羔性能的關(guān)系 Otsuka研究發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白中主要是以、和基因通過(guò)調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的增殖和類固醇的生成，在雌性動(dòng)物生殖過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Χie 等通過(guò)熒光定量PCR 發(fā)現(xiàn)，和基因在新西蘭兔的卵巢發(fā)育過(guò)程中均有表達(dá)，其中60 日齡的卵巢中和的表達(dá)量均顯著高于120 日齡和6 日齡，且基因的表達(dá)量始終高于基因的表達(dá)量。還有研究發(fā)現(xiàn)，基因可誘導(dǎo)人顆粒細(xì)胞中卵泡刺激素受體（FSHR）的表達(dá)，同時(shí)還降低促黃體生成素受體（LHR）和類固醇生成的急性調(diào)節(jié)蛋白（STAR）的表達(dá)，從而促進(jìn)卵泡的生成。魏強(qiáng)研究發(fā)現(xiàn)，基因位點(diǎn)的不同基因型與豬的總產(chǎn)仔數(shù)、活產(chǎn)仔數(shù)、斷奶頭數(shù)上差異極顯著。除此之外，張壯彪等發(fā)現(xiàn)基因在綿羊性腺軸的7 種組織中均有表達(dá),其中產(chǎn)多羔的小尾寒羊輸卵管、卵巢、下丘腦、垂體、小腦的表達(dá)量均高于產(chǎn)單羔蘇尼特羊。Zhang 等在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，基因的g.48462350C＞T 位點(diǎn)與小尾寒羊平均產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)（＜0.05），這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果不一致，可能是因?yàn)檫x擇的群體不同所導(dǎo)致的。因此，基因可能通過(guò)調(diào)控卵巢發(fā)育和卵巢功能對(duì)雌性動(dòng)物的產(chǎn)羔性能產(chǎn)生影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，基因的g.48462350C＞T 位點(diǎn)在杜泊羊、灘寒雜交羊、雜一代、雜二代、橫交一代5個(gè)綿羊群體中均表現(xiàn)為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），表明該位點(diǎn)在上述群體中存在較強(qiáng)的選擇和育種潛力?？ǚ竭m合性檢驗(yàn)分析表明，該位點(diǎn)在D 群體不處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)（＜0.05），這可能與本實(shí)驗(yàn)的人工選擇有關(guān)，在其他群體均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)（＞0.05），表明該位點(diǎn)在其他群體具有適應(yīng)性較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。進(jìn)一步與產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)不同基因型之間均與產(chǎn)羔數(shù)無(wú)顯著差異（＞0.05），即該位點(diǎn)不適用于上述5 個(gè)綿羊群體多羔性狀的選育。

3.2基因與產(chǎn)羔性能的關(guān)系 徐業(yè)芬等研究發(fā)現(xiàn)，基因mRNA 在湖羊多羔組中的表達(dá)量極顯著高于單羔組，其在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，基因mRNA 的表達(dá)量在高繁殖率的湖羊組中顯著高于低繁殖率的湖羊組。同時(shí)，韋濤的研究結(jié)果表明，湖羊卵巢組織基因mRNA 的表達(dá)水平與排卵數(shù)呈極顯著正相關(guān)，該基因A298C 位點(diǎn)AA 型個(gè)體第三胎產(chǎn)羔數(shù)和經(jīng)產(chǎn)平均產(chǎn)羔數(shù)均顯著高于AB 型，表明基因在湖羊卵泡發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。此外，孫振梅研究發(fā)現(xiàn)，在單多羔兩組黔北麻羊的垂體、輸卵管、子宮、下丘腦、卵巢5 個(gè)繁殖組織中均檢測(cè)到基因mRNA 的表達(dá)，其中在卵巢組織中的表達(dá)量最高，在下丘腦中最低，而且該研究還發(fā)現(xiàn)在黔北麻羊的卵巢組織中，多羔組基因的表達(dá)量顯著高于單羔組。Rajesh 等研究發(fā)現(xiàn)，和基因可刺激雌激素的產(chǎn)生并且促進(jìn)水牛卵巢卵泡中顆粒細(xì)胞的存活。還有研究發(fā)現(xiàn)，基因可以促進(jìn)雞原始生殖細(xì)胞的生成。上述結(jié)果均表明，基因?qū)Υ菩詣?dòng)物產(chǎn)羔性能的作用十分重要。

本研究發(fā)現(xiàn)，基因的g.63454744T＞G 位點(diǎn)在5 個(gè)綿羊群體中均表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC＜0.25），表明該位點(diǎn)在上述綿羊群體中具有較小的選擇潛力。經(jīng)卡方適合性檢驗(yàn)分析，該位點(diǎn)在5 個(gè)綿羊群體中均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)（＞0.05），說(shuō)明該位點(diǎn)具有適應(yīng)性較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。進(jìn)一步與產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)不同基因型之間均與產(chǎn)羔數(shù)無(wú)顯著差異（＞0.05），即該位點(diǎn)不適用于上述5 個(gè)綿羊群體多羔性狀的選育。

3.3基因與產(chǎn)羔性能的關(guān)系對(duì)動(dòng)物繁殖性能具有重要的調(diào)控作用，在卵巢組織中的表達(dá)水平以及基因多態(tài)性均與家畜的繁殖力有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，洛克豬和豫南黑豬群體外顯子區(qū)存在T98C 位點(diǎn)多態(tài)位點(diǎn)，AA 型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)顯著高于AB 型；蘇淮豬基因3'-UTR 區(qū)c.*273A＞G，其多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)性狀顯著關(guān)聯(lián)，AA 型個(gè)體產(chǎn)仔數(shù)高于GG 型。在綿羊群體中，基因?qū)Ξa(chǎn)羔性能的影響也有研究，Χu 等發(fā)現(xiàn)湖羊多羔母羊卵泡中的mRNA 表達(dá)量顯著高于單羔個(gè)體；張壯彪等發(fā)現(xiàn)基因在繁殖性能高的小尾寒羊輸卵管、卵巢、下丘腦、垂體、大腦中的表達(dá)量均高于蘇尼特羊；Zhang 等發(fā)現(xiàn)小尾寒羊的基因啟動(dòng)子區(qū)g.58171886A＞C 突變位點(diǎn)多態(tài)性與產(chǎn)羔性狀顯著關(guān)聯(lián)，CC 型個(gè)體產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AC 型和AA 型。上述結(jié)果表明，基因?qū)d羊產(chǎn)羔性能的影響非常重要，可作為綿羊繁殖性狀的候選基因。

本研究發(fā)現(xiàn)，基因的g.58171856C＞G 位點(diǎn)在5 個(gè)綿羊群體中均表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC＜0.25），表明該位點(diǎn)在上述綿羊群體中具有較小的選擇潛力。經(jīng)卡方適合性檢驗(yàn)分析，該位點(diǎn)在5 個(gè)綿羊群體均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)（＞0.05），說(shuō)明該位點(diǎn)在選擇過(guò)程中適應(yīng)性較強(qiáng)。進(jìn)一步與產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)不同基因型之間均與產(chǎn)羔數(shù)無(wú)顯著差異，即該位點(diǎn)不適用于上述5 個(gè)綿羊群體多羔性狀的選育，這與上述討論結(jié)果存在差異，可能原因是所選群體不同造成的。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，基因g.48462350C＞T 和基因g.63454744T＞G 以及基因g.58171856C＞G位點(diǎn)多態(tài)性與上述5 個(gè)綿羊群體產(chǎn)羔數(shù)均不顯著，不適用于在5 個(gè)綿羊群體中多羔性狀的選育。