雞骨液酶解工藝優(yōu)化及其酶解前后風味物質分析

李澤林，王秋婷，郭其洪，桂海佳，谷大海，王雪峰，肖智超，王桂瑛，范江平

（云南農業(yè)大學食品科學技術學院，云南昆明 650201）

我國是雞肉等禽肉生產大國，2020年肉雞總產量約為1485萬噸，是四大肉雞主產國之一，肉雞在加工過程中會產生大量副產品，其中雞骨就是主要副產物之一[1]。雞骨中含有豐富的蛋白質（含量可達16.3%與等量雞肉相似）、脂肪、礦物質、氨基酸、軟骨素、酸性黏多糖和維生素等多種營養(yǎng)素，比例均衡、生物價高，是優(yōu)質的蛋白源[2?3]；目前，有少部分雞骨被制作成雞骨泥或粉添加到食品中，有部分被用來制作明膠、提取雞骨素和蛋白水解物等[4]；雞骨被水解后會釋放大量的呈味游離氨基酸，還會產生和諧的香氣，具有良好的制作調味料基料的潛質；但是，鮮有文獻報道雞骨酶解前后關鍵的風味化合物，因此探明雞骨關鍵呈味游離氨基酸和關鍵香氣化合物有助于推動以雞骨為基料的食品風味機制的探究。

味覺活性值[5]（taste activity value，TAV）和香氣活性值[6]（odor activity value，OAV）是評價食品中化合物對滋味和香氣貢獻大小的重要量化指標；前者可以評價化合物，如游離氨基酸對食品酸、甜、苦、咸、鮮滋味的貢獻度，后者則可以評估揮發(fā)性化合對食品香氣輪廓的貢獻[7]。目前，TAV和OAV已被廣泛應用到食品領域，用來評估分析食品成分對滋氣味的影響。張曼等[8]結合TAV和OAV篩選發(fā)現(xiàn)不同產地的鮮辣椒沒有特征凸出的呈味氨基酸，有17種關鍵香氣成分（OAV>1），其中2-甲氧基-3-異丁基吡嗪、乙酸己酯、α-合金歡烯是構成鲊辣椒風味的關鍵物質。孫圳等[9]在鹵制雞肉中發(fā)現(xiàn)正辛醛、反-2-癸烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇和芳樟醇OAV>1，并確定這些化合物為鹵制雞肉的關鍵香氣物質。

因此，為了探究雞骨液酶解前后游離氨基酸及揮發(fā)性香氣成分的變化情況，本研究擬展開雞骨液酶解工藝優(yōu)化研究，并分析酶解前后的游離氨基酸及揮發(fā)性成分，以篩選出對其滋味和香氣有關鍵貢獻的游離氨基酸和揮發(fā)性香氣化合物。旨在為雞骨的綜合利用以及其風味的深入研究提供實驗基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白羽肉雞全骨（干凈剔除雞身所有肉、油、皮和筋） 云南農業(yè)大學實驗雞場提供；動物蛋白水解酶（食品級，4萬U/g）、風味蛋白酶（食品級，5萬U/g） 浙江一諾生物科技有限公司；C7～C30正構烷烴標準品、3-辛醇標準品 美國Sigma公司；硫酸 天津市風船化學試劑科技有限公司。

PL303型分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；PHS-3C型雷磁pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；S-433型氨基酸自動分析儀 德國sykam公司；SCION SQ 456-GC型氣質聯(lián)用儀 美國力可有限公司；DB-WAX型色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm） 安捷倫科技（中國）有限公司；PG-150型碎骨機 諸城市廣優(yōu)機械科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雞骨液酶解工藝 取雞骨→碎骨機破碎（過60目篩）→加水混勻→調節(jié)pH→加入酶→水浴酶解→滅酶→離心→取上清液備用。

操作要點：雞骨勻漿液先調整pH到7使其達到動物蛋白酶與風味酶最適値，再加入酶（兩者比例1:1，w/w）；待酶解完成后，酶解液沸水浴滅酶10 min；最后在4000 r/min條件下離心15 min。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 酶解時間對樣品水解度的影響 以水解度為指標，固定料液比1:3 g/mL、酶解溫度50 ℃、復合酶添加量0.5%，探討不同酶解時間（3、4、5、6 h）下樣品水解度的大小。

1.2.2.2 酶解溫度對樣品水解度的影響 以水解度為指標，固定酶解時間5 h、料液比1:3 g/mL、復合酶添加量0.5%，探討不同酶解溫度（45、50、55、60 ℃）下樣品水解度的大小。

1.2.2.3 料液比對樣品水解度的影響 以水解度為指標，固定酶解時間5 h、酶解溫度50 ℃、復合酶添加量0.5%，探討不同料液比（1:2、1:3、1:4、1:5 g/mL）下樣品水解度的大小。

1.2.2.4 酶添加量對樣品水解度的影響 以水解度為指標，固定酶解時間5 h、酶解溫度50 ℃、料液比1:3 g/mL，探討不同復合酶添加量（0.4%、0.5%、0.6%、0.7%）下樣品水解度的大小。

1.2.3 響應面試驗 根據單因素實驗結果，固定酶解溫度50 ℃進行三因素三水平響應面試驗設計，因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平設計Table 1 Factor level design of response surface test

1.2.4 水解度測定 氨基酸態(tài)氮的測定：根據GB 5009.235《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》的方法進行測定；總氮的測定：根據GB 5009.5《食品中蛋白質的測定》的方法進行測定。按照公式（1）計算水解度：

1.2.5 游離氨基酸測定 取酶解前后的雞骨液進行游離氨基酸的測定：根據GB 5009.124《食品中氨基酸的測定》的方法使用氨基酸自動分析儀進行檢測。

1.2.6 味覺活性值計算 參考Zhang等[10]的方法，利用味覺活性值（taste activity value，TAV）評價各呈味氨基酸對雞骨液滋味的影響。按以下公式（2）計算TAV：

1.2.7 揮發(fā)性成分的GC-MS檢測 樣品處理：取酶解前后雞骨液樣品6 mL于頂空瓶（20 mL）中，插入萃取頭萃取30 min（60 ℃）后取出，再插入氣相色譜進樣口解吸3 min（250 ℃）。GC條件：色譜柱：DBWAX石英毛細柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱流量：恒流的模式進樣（0.8 mL/min）；載氣：高純度氦氣；起始溫度40 ℃（3 min），第一階段5 ℃/min升至90 ℃，第二階段10 ℃/min升至250 ℃（6 min）；進樣口的溫度為250 ℃。MS條件：離子源：EI；離子源溫度200 ℃；電壓70 eV；色譜-質譜接口溫度250 ℃。

揮發(fā)性化合物定性：將質譜數(shù)據與相應標準進行比對，并與NIST 14的數(shù)據進行比較。保留指數(shù)（RI）的計算方法如下：以標準品保留時間和相同色譜條件下C7～C30正構烷烴的保留時間計算檢測物質的保留指數(shù)（RI）。定量：對揮發(fā)性化合物定量時添加3-辛醇為內標物，以內標物的峰面積與氣味活性化合物的峰面積比值計算各物質的含量。

1.2.8 香氣活性值計算 參考Yang等[11]的方法，利用香氣活性值（odor activity value，OAV）評價各揮發(fā)性化合物對雞骨液酶解前后香氣輪廓的影響。按以下公式（3）計算OAV：

1.3 數(shù)據處理

試驗均重復三次取平均數(shù)，使用設計專家設計響應面試驗，Excel 2016制作雷達圖及數(shù)據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 酶解溫度對水解度的影響 由圖1a可知，當酶解溫度在45～50 ℃時，水解度隨著溫度升高而增加，當溫度為50 ℃時，水解度最大32.46%±0.68%。當酶解溫度高于50 ℃時水解度隨著溫度的升高而下降，原因是溫度過高引起蛋白質分子過度聚合，酶的活力受到影響，酶蛋白變性，水解度隨之降低。因此，50 ℃為最優(yōu)酶解溫度。

圖1 單因素實驗結果Fig.1 Single factor test results

2.1.2 酶解時間對水解度的影響 由圖1b可知，酶解3～5 h時水解度逐漸增大，酶解5 h時水解度最高33.79%±0.84%，酶解時間繼續(xù)增加化學反應平衡后，反應向反方向進行，水解度降低。因此，5 h為最優(yōu)酶解時間。

2.1.3 酶添加量對水解度的影響 由圖1c可知，隨著酶添加量的增加、酶活增大，水解度增高，當酶添加量為0.6%時，水解度最大33.72%±0.48%，當超過0.6%時水解度下降。因此，酶添加量0.6%為最優(yōu)值。

2.1.4 料液比對水解度的影響 由圖1d可知，隨著料液比的減小，雞骨的水解度呈先增大后減小的趨勢，在料液比為1:3 g/mL時，雞骨的水解度最大為32.7%±1.07%。料液比決定了酶解底物的濃度，在1:2 g/mL時因底物的濃度過高，影響了反應的化學平衡導致水解度低；當料液比超過1:3 g/mL時，反應底物的濃度過低，化學反應變慢，導致水解度下降。因此，1:3 g/mL為最佳料液比。

2.2 響應面試驗結果

根據單因素的實驗結果，在溫度50 ℃、復合酶比例1:1條件下，通過響應面試驗設計，對酶解雞骨液工藝進一步優(yōu)化。結果如表2所示。

表2 響應面設計及結果Table 2 Response surface design and results

對表2數(shù)據進行回歸分析，結果得到二次多項回歸方程為：Y=33.15+1.68A+1.23B+1.59C?1.92AB?2.07AC?0.90BC?2.08A2?2.38B2?1.39C2

根據表3，對回歸模型方差進行分析。模型P<0.01，失擬項P=0.2940>0.05，說明模型顯著具有可行性。模型的決定系數(shù)R2=0.9604，R2Adj=0.9094，兩者相差較小，說明此模型可用于分析酶解雞骨的工藝優(yōu)化。模型中，一次項A、B、C，交互項AB和AC，二次項A2、B2對水解度的影響極顯著（P<0.01），根據F值可以得出因素對水解度的影響順序依次為酶解時間>料液比>酶添加量。

表3 回歸模型方差分析及模型顯著性檢驗Table 3 Regression model analysis of variance and model significance test

2.3 交互作用分析及模型驗證

響應曲面圖與等高線圖可以反映兩個變量之間的交互類型以及各因素對水解度影響的顯著性。由圖2a～c可知，隨著因素的增大，水解度先增大后下降，這與單因素實驗結果相一致。圖2a～b的等高線圖屬于橢圓形，說明交互作用顯著，而圖2c的等高線圖接近圓形，說明交互作用不顯著，這與方差分析表中的結果相一致。

圖2 各因素交互作用響應曲面及等高線圖Fig.2 Response surface and contour plot of interaction of various factors

通過模型得到的最優(yōu)結果為：時間5.1 h、酶添加量0.61%、料液比1:3 g/mL，水解度為33.68%±1.53%。根據此工藝條件進行3組重復試驗，并計算其水解度的平均值為33.24%±0.61%，與理論值相比無顯著性差異（P＞0.05），說明該工藝具有可行性。

2.4 酶解對雞骨液游離氨基酸含量及味覺活性值的影響

雞骨中的蛋白質有90%以上屬于結構性的膠原蛋白、呈纖維狀，其含量占機體總蛋白的25%～30%[12]，這些蛋白被酶解后可添加到風味基料和調味料中以增強其風味的豐富度及層次感。由表4可知，雞骨酶解前游離氨基酸含量較低，呈甜味的氨基酸總含量最高僅為535.37 mg/kg，酶解后17種游離氨基酸含量均極顯著（P<0.01）增加，以苦味氨基酸增幅最大總含量達到了9776.58 mg/kg，相比酶解前增加了27.9倍，與丁小燕等[13]研究的雙酶水解雞骨泥結果一致。雖然苦味氨基酸在酶解后極顯著（P<0.01）增加，但苦味氨基酸不具備味覺活性，且其苦味易被其他呈味氨基酸的味道掩蓋[14]。此外，呈甜味的精氨酸與呈鮮味的谷氨酸協(xié)同作用下可以呈現(xiàn)令人愉快的味道，也可以掩蓋大部分苦味。所以，雞骨酶解液滋味主要以鮮味和甜味為主。

表4 雞骨液酶解前后游離氨基酸含量、閾值、呈味特性及TAV值Table 4 Contents, thresholds in water, taste contribution and TVA value of free amino acids in chicken bone homogenate before and after enzymolysis

當TAV值大于1時，認為該物質具有強烈的滋味活性，對食物的整體滋味輪廓貢獻大，且TAV的大小和其對滋味貢獻成正比[15]。本研究酶解前游離氨基酸的TAV只有谷氨酸（8.76）、丙氨酸（2.65）、纈氨酸（1.43）和賴氨酸（5.56）大于1，酶解后所有檢測到的游離氨基酸TAV均大于1。其中，天門冬氨酸（13.85）、谷氨酸（78.92）、丙氨酸（24.60）、纈氨酸（41.09）、蛋氨酸（32.30）、異亮氨酸（16.52）、亮氨酸（13.97）和賴氨酸（81.99）的TAV均大于10遠大于1，對其整體風味貢獻極強。

2.5 酶解前后雞骨液揮發(fā)性風味物質的變化

續(xù)表 4

續(xù)表 5

續(xù)表 5

采用HS-SPME-GC-MS對酶解前后的雞骨液檢測，結果如表5所示，共檢測出揮發(fā)性化合物92種，酶解前63種，酶解后66種，其中包含了27個醇、10個酮、9個酸、7個酯、15個烴類、1個酚、3個雜環(huán)和20個醛類。這些化合物構成了雞骨酶解前后的揮發(fā)性風味輪廓，醇和酸類相對含量在酶解后增加，醛類、烴類和酮類減少，說明這些化合物含量的變化使酶解前后雞骨液揮發(fā)性組成成分以及其對香氣的貢獻有所差別。

表5 雞骨液酶解前后揮發(fā)性成分比較Table 5 Comparison of volatile components of chicken bone homogenate before and after enzymatic hydrolysis

醇和酸主要是賦予食物芳香、花香、甜味、水果味、酸味和蘑菇味的主要來源，酸可以由氨基酸降解后經氧化或還原作用產生，也可能由飽和脂肪酸本身氧化降解產生，是酯類化合物合成的前體物質[16?18]。本研究中，酶解后辛醇、1,2-庚二醇、芳樟醇、薄荷醇和庚酸、壬酸、戊酸等對花香、香甜、酸香和水果香有貢獻的化合物含量增加。烴類化合物可能是由脂質自氧化產生，且大部分烴類物質被報道香氣較弱或無氣味[19]；醛類也可以由食物中脂肪酸的氧化和蛋白質的Strecker降解反應而生成且氣味閾值較低[20]，與酮類等揮發(fā)性化合物具有麥芽味、青草味、甜味、烤面包香、焦糖香和咖啡香等[21?22]。本研究中，1-辛烯-3-酮、5-甲基-3-庚酮、甲基庚烯酮和正戊醛、己醛、壬醛、苯甲醛等在酶解后消失或者含量降低會造成香氣的減弱，但反式-2-癸烯醛、十四醛、庚醛和十六醛等的增加會減少青草味等不愉快的氣味。此外，酶解后2-戊基呋喃、2-乙基呋喃和2-正丁基呋喃含量的增加會增強雞骨液的烤香味。

2.6 雞骨液關鍵揮發(fā)性香氣成分及其香氣輪廓分析

OAV是將GC-MS所測定的揮發(fā)性化合物濃度與每種揮發(fā)性化合物對應的嗅覺閾值相結合分析，可有效地評估每一個揮發(fā)性成分對樣品香氣輪廓的貢獻大小[23]?；衔锏腛AV大于或等于1說明該揮發(fā)性成分能被感官察覺且對雞骨的整體香氣貢獻較大。

由表6可知，雞骨液酶解前后OAV≥1的風味物質共有17種，其中酶解前13種、酶解后16種，包括醇類4種、酯類2種、呋喃類2種、醛類9種，酶解后OAV≥1的揮發(fā)性化合物增加，香氣輪廓更加豐富。與上述結果一致，低閾值的醛類對香氣是貢獻最大的，其OAV也大。酶解后雞骨液中己醛（OAV：147.51）、辛醛（OAV：232.33）、壬醛（OAV：16.89）、苯甲醛（OAV：5.17）、反,反-2,4-癸二烯醛（OAV：706.33）、1-辛烯-3-醇（OAV：346.67）、庚醇（OAV：3.25）、己酸乙酯（OAV：0.54）的含量及OAV下降，降低了揮發(fā)性物質產生的花香、果香以及蠟味等香氣，但是芳樟醇（OAV：2.29）、正壬醇（OAV：16.82）、2-戊基呋喃（OAV：59.49）、2-正丁基呋喃（OAV：1.11）、2-辛烯醛（OAV：160.45）、反式-2-癸烯醛（OAV：180.97）、庚醛（OAV：3.95）的含量及OAV上升，增加了瓜香、肉香、烘烤香、動物油脂味，使整體風味更加和諧。

表6 雞骨液酶解前后揮發(fā)性風味物質的OAVTable 6 OAV of volatile flavor compounds of chicken bone homogenate before and after enzymatic hydrolysis

雞骨液酶解前后的揮發(fā)性香氣包含了水果香、花香、脂肪香、瓜香、草味、烘烤香、肉香、蘑菇、檸檬味和綠豆味。根據香氣化合物的風味特征，以及參照香氣輪中的模塊分類可以將計算得到OAV≥1的各香氣化合物繪制香氣輪廓圖[30]。如圖3所示，酶解后香氣輪廓比酶解前小，特別酶解前呈脂肪味的揮發(fā)性組分總OAV達到了2415.38，使雞骨液的脂肪味過于凸出，而掩蓋其它化合物的香氣，但是酶解后下降到了1081.48，相比于與酶解前減小了2.23倍，很大程度的降低了脂肪味；雖然酶解會降低呈花香、果香果香的化合物濃度，但是增加了呈烘烤、綠豆、瓜香和肉香化合物的濃度，從而讓雞骨酶解液香氣更豐富，接受度會更高，與鄭曉杰等[31]的研究結果相似。

圖3 雞骨液酶解前后風味輪廓Fig.3 Flavor profile of chicken bone homogenate before and after enzymatic hydrolysis

3 結論

雞骨是肉雞加工過程中產生的主要可利用副產物，含有豐富的蛋白質、氨基酸等，具有較好的開發(fā)價值。本研究發(fā)現(xiàn)，共有13個游離氨基酸的TAV大于1，其中天門冬氨酸（13.85）、谷氨酸（78.92）、丙氨酸（24.60）、纈氨酸（41.09）、蛋氨酸（32.30）、異亮氨酸（16.52）、亮氨酸（13.97）和賴氨酸（81.99）大于10，對雞骨液滋味貢獻極大。共鑒定出揮發(fā)性化合物92種，酶解前63種，酶解后66種，其中OAV≥1酶解前13種、酶解后16種，包括醇類4種、酯類2種、呋喃類2種、醛類，酶解前雞骨液有強烈的脂肪味，酶解后脂肪味減弱其OAV降低了2.23倍，同時花香、果香香氣貢獻減低，但是增加了烘烤、綠豆、瓜香和肉香的貢獻。可為今后雞骨酶解風味的研究提供試驗基礎和理論依據，但是為了更準確的對其香氣輪廓的表征，在后續(xù)的研究中可以增加嗅聞、香氣缺失和香氣重組等試驗。