急性胰腺炎胰酶異常活化和分泌的分子機(jī)制

崔恬玉， 劉瑞霞， 陰赪宏

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院 a.內(nèi)科， b.中心試驗(yàn)室， 北京 100026

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是一種臨床常見急腹癥，發(fā)病率為34/10萬，在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢[1]，其中重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)常合并嚴(yán)重并發(fā)癥，病死率達(dá)15%～35%[2-3]，嚴(yán)重威脅人民生命健康，并帶來巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。這主要是由于缺乏治療AP的特效藥物，臨床治療仍以奧曲肽[4-5]、烏司他丁等藥物治療為主，但效果欠佳。因此深入探索AP發(fā)病機(jī)制，尋找理想的治療靶點(diǎn)十分重要。

AP的發(fā)病機(jī)理十分復(fù)雜，其中胰酶異?；罨头置谑且认傧倥菁?xì)胞中的早期病理事件[6]，也是AP發(fā)生發(fā)展的始發(fā)因素。近年來，胰酶異?；罨头置诘募?xì)胞內(nèi)分子機(jī)制研究取得新進(jìn)展，本文將從胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)病理事件和調(diào)控分子角度，歸納胰酶異?；罨头置诘臋C(jī)制。

1 AP胰酶異?；罨募?xì)胞內(nèi)機(jī)制

胰腺外分泌部的主要生理功能是分泌胰液進(jìn)入小腸，發(fā)揮消化吸收作用。胰蛋白酶原等胰酶前體是胰液的主要成分之一，由胰腺腺泡細(xì)胞合成、貯存和分泌。胰酶前體于腺泡細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)中合成，經(jīng)高爾基體加工后形成含有酶原顆粒(zymogen granules，ZG)的內(nèi)吞囊泡。胰酶前體無活性，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)存在保護(hù)機(jī)制(活化后胰酶的自溶作用和特定胰酶抑制劑等)以避免胰酶前體激活，防止自身消化[7]損傷細(xì)胞。而AP早期病理損傷多由胰腺腺泡細(xì)胞中胰蛋白酶原提前激活引起。在AP相關(guān)病因(如膽結(jié)石和酒精濫用等)作用下，腺泡細(xì)胞內(nèi)防止胰酶前體激活或降低胰酶活性的保護(hù)機(jī)制障礙，胰酶前體被提前活化為胰酶，進(jìn)而多種酶(如彈性蛋白酶和磷脂酶A2)以及補(bǔ)體和激肽途徑被激活，同時(shí)促炎因子分泌增加，造成胰腺局部損傷和炎癥反應(yīng)。目前胰酶異?；罨募?xì)胞機(jī)制主要包括鈣離子(Ca2+)超載、溶酶體與ZG的共定位和細(xì)胞器損傷。

1.1 Ca2+超載 胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號調(diào)控是胰酶前體激活的關(guān)鍵信號分子，而Ca2+超載是AP發(fā)生的中心事件[8]。生理環(huán)境中，副交感神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿等刺激性神經(jīng)遞質(zhì)，通過胰腺腺泡細(xì)胞膜上G蛋白偶聯(lián)受體激活磷脂酶C，促進(jìn)細(xì)胞膜表面的磷脂酰肌醇4，5二磷酸水解產(chǎn)生二級信使三磷酸肌醇(inositol 1，4，5-trisphosphate，InsP3)。InsP3作用于ER上三磷酸肌醇受體(inositol 1，4，5-trisphosphate receptors，InsP3Rs)，打開InsP3依賴性鈣通道，促進(jìn)ER中大量Ca2+釋放入細(xì)胞質(zhì)中[9]；同時(shí)細(xì)胞膜上Ca2+通道打開，胞外Ca2+內(nèi)流，參與激活I(lǐng)nsP3Rs和ryanodine受體，進(jìn)一步促進(jìn)Ca2+從ER釋放。最終細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流和ER中Ca2+釋放引起腺泡細(xì)胞頂端側(cè)區(qū)域的Ca2+濃度瞬時(shí)峰值，啟動酶原胞吐作用，并刺激線粒體中ATP的產(chǎn)生，為胰酶分泌提供能量[10]。并且胞外Ca2+內(nèi)流和ER中Ca2+釋放這兩條路徑之間存在相互作用。ryanodine受體是鈣敏感通道，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的輕度升高即可誘導(dǎo)其開放，介導(dǎo)Ca2+從ER釋放。Orai1通道位于胞膜上，屬于鈣庫調(diào)控的Ca2+通道，STIM1為Orai1通道的調(diào)控因子，位于ER膜上，可感知ER內(nèi)Ca2+耗竭并向質(zhì)膜遷移，與Orai1相互作用后打開鈣庫調(diào)控的Ca2+通道，誘導(dǎo)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流[11]。

AP相關(guān)病因(高脂血癥、酒精和膽汁酸等)刺激下，腺泡細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)胞外Ca2+過量流入或胞質(zhì)內(nèi)Ca2+清除機(jī)制異常，造成胞漿內(nèi)Ca2+超載。AP時(shí)細(xì)胞膜和ER膜的通透性增加，促進(jìn)胞外和ER中Ca2+過量流入細(xì)胞質(zhì)中。正常情況下，胞漿內(nèi)Ca2+濃度一旦過度增加，細(xì)胞可通過ER和胞膜上的Ca2+泵迅速發(fā)揮代償作用，分別將Ca2+移回ER或排出胞外[8]，清除胞質(zhì)內(nèi)多余Ca2+，而Ca2+泵的代償作用需要ATP供能維持。但是胞漿內(nèi)Ca2+濃度持續(xù)性病理升高會導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)以高電導(dǎo)狀態(tài)打開，損傷生成ATP[12-14]所需的膜電位，導(dǎo)致ATP耗竭，進(jìn)而直接抑制腺泡細(xì)胞內(nèi)Ca2+清除作用。Mukherjee等[12]也在CD1小鼠AP模型中證實(shí)胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度持續(xù)升高可打開MPTP，造成胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)線粒體損傷、ATP生產(chǎn)受阻；敲除MPTP基因及藥物阻滯MPTP后發(fā)現(xiàn)胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)線粒體損傷減輕，ATP生成水平正常，進(jìn)一步證實(shí)了抑制MPTP開放對AP線粒體損傷和ATP耗竭的保護(hù)作用。

AP時(shí)Ca2+超載可激活Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calmodulin-dependent serine/threonine phosphatase calcineurin，PP2B)，促進(jìn)酶原活化[7]。Shah等[15]利用PP2B抑制劑FK506分別于1 h和8 h干預(yù)AP小鼠，發(fā)現(xiàn)與1 h相比8 h小鼠胰腺內(nèi)胰蛋白酶活性降低50%以上，血清淀粉酶降低86%，提示AP早期胰蛋白酶活化與PP2B活性相關(guān)。此外，Ca2+也可作為輔助因子參與胰酶自身激活過程，促進(jìn)胰蛋白酶提前活化。雖然腺泡細(xì)胞內(nèi)存在胰蛋白酶抑制劑，可通過降解胞質(zhì)內(nèi)低活性胰酶來自我保護(hù)，避免自消化損傷。但Ca2+可與胰蛋白酶激活肽的氮端天冬氨酸殘基結(jié)合，增強(qiáng)胰酶的穩(wěn)定性和活性，降低胰蛋白酶抑制劑對腺泡細(xì)胞的保護(hù)作用。已有研究[16]證實(shí)，增加的腺泡細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度可直接促進(jìn)胰蛋白酶原的激活。Dantrolene是RyR的藥理拮抗劑，Orabi等[17]使用Dantrolene(RyR拮抗劑)干預(yù)AP小鼠，通過減弱胰腺腺泡胞Ca2+內(nèi)流降低胞漿內(nèi)Ca2+濃度，發(fā)現(xiàn)酶原激活水平以及胰腺損傷程度均減輕。

1.2 溶酶體與ZG的共定位 胰酶以非活性ZG形式貯存于腺泡細(xì)胞胞質(zhì)中。在AP早期階段，腺泡細(xì)胞內(nèi)溶酶體和ZG生成增加，并且二者發(fā)生融合現(xiàn)象，此過程稱為共定位，導(dǎo)致胰蛋白酶原提前活化[6]。ZG與溶酶體融合后，組織蛋白酶 B(CathepsinB, CatB)(一種主要的溶酶體酶)將胰蛋白酶原激活為具有消化功能的胰酶[18]。胰酶和CatB從內(nèi)吞液泡內(nèi)釋放的機(jī)理尚未完全闡明，有研究者[19]認(rèn)為活化后的胰酶可引起膜脆性的增加，導(dǎo)致內(nèi)吞液泡泄漏，釋放胰酶和CatB；還有研究[20]認(rèn)為，發(fā)生共定位的內(nèi)吞液泡可能會誘使細(xì)胞骨架和/或細(xì)胞器破裂；溶酶體和ZG膜也可能分別由于酒精的代謝產(chǎn)物和膜穩(wěn)定糖蛋白2的缺失而變得脆弱。上述原因均可能促進(jìn)內(nèi)吞液泡釋放胰酶，在腺泡細(xì)胞內(nèi)外引起自身消化，造成胰腺損傷和全身炎癥反應(yīng)[21]，加速AP的發(fā)生發(fā)展。

1.3 細(xì)胞器損傷 AP可通過損傷ER和線粒體等細(xì)胞器功能，促進(jìn)胰酶提前激活。ER是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、折疊和聚集的重要細(xì)胞器。ER可通過泛素-蛋白酶體途徑將未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)清除，保證合成蛋白質(zhì)的質(zhì)量。外部刺激(如氧化應(yīng)激或Ca2+超載)可引發(fā)ER中錯誤折疊的蛋白質(zhì)過度聚集，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。ERS也是早期AP腺泡細(xì)胞中的重要反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)性AP中，早期ERS的發(fā)生與胰蛋白酶原激活有關(guān)[22-23]。AP腺泡細(xì)胞內(nèi)線粒體損傷-ATP耗竭-胰酶激活過程與Ca2+超載密切相關(guān)。

ERS和線粒體損傷除直接參與胰酶激活外，也與AP自噬損傷有關(guān)。自噬是一種細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，可處理和回收陳舊、有缺陷或已損壞的各種細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物[24]。AP腺泡細(xì)胞溶酶體功能障礙，促使溶酶體內(nèi)組織蛋白酶L(降解胰蛋白酶原和胰酶，抑制CatB激活胰蛋白酶原)和CatB比例失衡，導(dǎo)致自噬損傷，促進(jìn)自噬泡內(nèi)胰蛋白酶原激活[25]。自噬受損也會加重ERS和線粒體功能損傷，導(dǎo)致腺泡細(xì)胞更易遭受其他損傷和死亡[26-29]。Hashimoto等[30]利用雨蛙素誘導(dǎo)自噬相關(guān)基因5敲除的AP小鼠模型發(fā)現(xiàn)，胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)ZG的激活受到抑制，AP嚴(yán)重程度顯著降低。

腺泡細(xì)胞中的細(xì)胞器形成了一個聯(lián)動系統(tǒng)，任何細(xì)胞器受損可能都會導(dǎo)致整個網(wǎng)絡(luò)的故障。例如，通過ATG5或ATG7的遺傳消融或通過核因子κB激酶亞基抑制劑的基因缺失來阻止自噬，均導(dǎo)致ERS和線粒體功能紊亂，無法生成ATP，且由于胰蛋白酶原合成于ER，腺泡細(xì)胞合成和分泌胰酶功能也發(fā)生障礙[24,31]。相反，通過CypD基因消融恢復(fù)線粒體功能可減輕ERS并增加實(shí)驗(yàn)性AP中溶酶體-自噬系統(tǒng)的性能[26]。雖然已有大量研究發(fā)現(xiàn)腺泡細(xì)胞細(xì)胞器之間的相互作用可影響胰酶活化，甚至影響AP病程發(fā)展，但其具體分子機(jī)制仍需深入挖掘。

2 AP胰酶分泌抑制的細(xì)胞機(jī)制

生理刺激下，胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)頂端側(cè)Ca2+濃度出現(xiàn)瞬時(shí)峰值，促使內(nèi)吞囊泡向腺泡細(xì)胞頂端側(cè)運(yùn)輸，最終與頂端側(cè)胞膜融合，將酶原釋放入腺泡管內(nèi)(胰酶頂端側(cè)分泌)。酶原后進(jìn)入十二指腸，被腸激酶等消化酶活化后發(fā)揮生理功能。AP時(shí)患者胰酶腸道分泌減少，胰腺組織和血液中胰酶濃度增加，這是由腺泡細(xì)胞頂端側(cè)分泌受阻以及基底側(cè)分泌增強(qiáng)導(dǎo)致的。細(xì)胞內(nèi)堆積的ZG被提前激活后進(jìn)入胰腺組織，導(dǎo)致胰腺局部損傷和炎癥反應(yīng)；進(jìn)入血液后可造成全身炎癥反應(yīng)，促進(jìn)SAP的發(fā)生發(fā)展。

2.1 VAMP8介導(dǎo)的頂端側(cè)分泌受損和基底側(cè)分泌增強(qiáng)(圖1)

VAMP(vesicle associated membrane protein，VAMP)8和VAMP2屬于SNARE家族，廣泛存在于包裹ZG的囊泡(內(nèi)體)膜上，VAMP8和VAMP2是正常生理狀態(tài)下介導(dǎo)胰酶頂端側(cè)分泌的主要蛋白。然而AP時(shí)VAMP8介導(dǎo)的腺泡細(xì)胞胰酶頂端側(cè)分泌路徑完全阻斷，僅50%胰酶通過VAMP2介導(dǎo)的頂端側(cè)分泌，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ZG堆積[32]，胰酶分泌受阻。堆積的ZG更易與溶酶體發(fā)生共定位，導(dǎo)致胰酶提前活化。Messenger等[32]證實(shí)，超大劑量胰酶分泌激動劑刺激野生型和VAMP8基因敲除小鼠后，VAMP8基因敲除AP小鼠分離的胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)ZG堆積水平較野生型小鼠增加了4.5倍，但ZG與溶酶體共定位減少，最終腺泡細(xì)胞內(nèi)胰酶活性無明顯變化，提示VAMP8除參與ZG頂端側(cè)分泌外，還可能與囊泡間融合相關(guān)。

正常胰腺腺泡細(xì)胞中ZG分泌后，頂端側(cè)擴(kuò)大的早期內(nèi)體隔室通過Rab5介導(dǎo)的內(nèi)體順行運(yùn)輸，回收質(zhì)膜和VAMP8等胞吐相關(guān)蛋白，并且Rab5介導(dǎo)的內(nèi)體順行運(yùn)輸系統(tǒng)可促進(jìn) ZG裝配VAMP8，維持VAMP8介導(dǎo)的ZG頂端側(cè)分泌。說明在生理狀態(tài)下胰腺腺泡細(xì)胞VAMP8介導(dǎo)的ZG頂端側(cè)分泌依賴于Rab5參與調(diào)控的內(nèi)體運(yùn)輸[33]。AP時(shí)Rab5減少，導(dǎo)致VAMP8介導(dǎo)的ZG頂端側(cè)分泌路徑受損，ZG轉(zhuǎn)而與晚期內(nèi)體、溶酶體融合并提前活化，向基底側(cè)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)[34]。Messenger等[34-35]還發(fā)現(xiàn)無胰酶分泌激動劑刺激時(shí)，Rab5過表達(dá)能促進(jìn)VAMP8介導(dǎo)的ZG頂端側(cè)分泌，上調(diào)胰酶基礎(chǔ)分泌；Rab5過表達(dá)也可減少ZG與溶酶體融合，抑制胰酶提前活化。

2.2 肌動蛋白細(xì)胞骨架破壞和融合孔擴(kuò)張不足 肌動蛋白絲在調(diào)節(jié)胰腺腺泡細(xì)胞頂端側(cè)分泌中起重要作用，超最大劑量的雨蛙素可造成末端肌動蛋白網(wǎng)及其相關(guān)的中間絲的損失。Chvanov等[36]于免疫電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，過度刺激下胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白絲無法完整包裹ZG運(yùn)載囊泡，進(jìn)而囊泡出現(xiàn)相互融合、破裂，最終ZG頂端側(cè)分泌胞吐作用受損；然而基底側(cè)胞膜肌動蛋白絲增加，這可能與胰酶基底側(cè)增強(qiáng)有關(guān)。因此胰酶分泌阻滯可能是與膽囊收縮素過量刺激破壞肌蛋白細(xì)胞骨架有關(guān)，但詳細(xì)分子調(diào)控尚不明確。

生理狀態(tài)下，運(yùn)載ZG的內(nèi)吞囊泡與腺泡細(xì)胞頂端膜結(jié)合后形成足夠大的融合孔，酶原通過融合孔釋放入腺泡管內(nèi)，目前認(rèn)為依賴ATP供能的融合孔擴(kuò)張?jiān)赯G分泌中起關(guān)鍵作用。AP致使融合孔擴(kuò)張不足，造成酶原等大分子蛋白質(zhì)無法通過融合孔，頂端側(cè)分泌受阻，也有研究者認(rèn)為融合孔擴(kuò)張不足與細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載引起的ATP耗竭有關(guān)[37]，融合孔擴(kuò)張不足的具體機(jī)制同樣不明確。

圖1 VAMP8介導(dǎo)的頂端側(cè)分泌受損和基底側(cè)分泌增強(qiáng)示意圖

3 結(jié)語

胰酶異常活化和分泌是AP發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。早期胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、溶酶體與ZG的共定位和細(xì)胞器損傷均可導(dǎo)致胰酶提前活化；而胰酶頂端側(cè)分泌受阻和基底側(cè)分泌增加、肌動蛋白細(xì)胞骨架破壞和融合孔擴(kuò)張不足可致胰酶異常分泌。胰酶異?；罨头置诳芍苯哟龠M(jìn)全身炎癥反應(yīng)和多器官系統(tǒng)損傷的發(fā)生，導(dǎo)致SAP，增加病死率。因此深入探索胰酶異常活化和分泌的細(xì)胞機(jī)制，尋找早期阻斷AP發(fā)生發(fā)展的靶向治療藥物十分關(guān)鍵，可有效降低SAP的發(fā)生率和病死率。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：崔恬玉負(fù)責(zé)擬定寫作思路，檢索文獻(xiàn)，撰寫論文；劉瑞霞、陰赪宏負(fù)責(zé)指導(dǎo)、修改論文并最終定稿。