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    誘導(dǎo)性低溫復(fù)蘇對失血性休克大鼠肺PGC-1表達(dá)影響

    2022-05-14 08:09:20高廣榮王鑫宇呂晨光石三保段福孝
    臨床軍醫(yī)雜志 2022年4期
    關(guān)鍵詞:誘導(dǎo)性失血性活性氧

    高廣榮,王鑫宇,呂晨光,石三保,段福孝,張 成

    北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 普通外科,遼寧 沈陽 110016

    創(chuàng)傷是中青年人群死亡的主要原因之一,全球每年約580多萬人死于創(chuàng)傷。其中,創(chuàng)傷失血性休克占創(chuàng)傷早期死亡的30%~40%。目前,雖然醫(yī)學(xué)救治水平不斷進(jìn)步,但是創(chuàng)傷失血性休克致死率仍保持在相對較高的水平[1-2]。動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)性低溫復(fù)蘇可明顯改善失血性休克的預(yù)后[3]。進(jìn)一步研究證實(shí),誘導(dǎo)性低溫復(fù)蘇可通過降低機(jī)體代謝率、增加能量儲備等方式減少能量耗損,進(jìn)而提高復(fù)蘇效率[4]。PGC-1是參與能量代謝調(diào)控的重要基因[5]。目前,失血性休克誘導(dǎo)性低溫復(fù)蘇對PGC-1有何影響尚不明確。本研究旨在探討誘導(dǎo)性低溫復(fù)蘇對失血性休克大鼠肺PGC-1表達(dá)的影響?,F(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級成年雄性Wistar大鼠18只(體質(zhì)量280~310 g),由北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室提供。Datex-Ohmeda S/5多功能監(jiān)護(hù)儀(芬蘭德恩公司),壓力傳感器(新加坡 Biosensors International PET.Ltd),PCR擴(kuò)增儀(德國Biometra),高速離心機(jī)(美國Sigma公司),微量輸液泵(浙大醫(yī)學(xué)器械有限公司W(wǎng)Z-50cz)。RNA固定液(北京天恩澤基因科技有限公司);實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒(大連寶生物工程大連有限公司)。PGC-1引物合成(大連寶生物工程大連有限公司)。PGC-1(sc-13067)抗體(SANTA CRUZ公司)。

    1.2 動物分組及模型制備 將大鼠隨機(jī)分為A組(對照)、B組(37℃~38℃常溫復(fù)蘇)及C組(33℃~34℃低溫復(fù)蘇)3組,每組各6只。A組僅行外科插管操作。B組、C組建立失血性休克模型后分別在預(yù)定溫度下進(jìn)行復(fù)蘇。按照標(biāo)準(zhǔn)建立壓力控制失血性休克模型。戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉,麻醉成功后進(jìn)行氣管內(nèi)插管和小動物呼吸機(jī)輔助呼吸,潮氣量設(shè)定為7~8 ml/kg,呼吸頻率設(shè)定為80次/min,吸入氧濃度為40%。進(jìn)行雙側(cè)股動脈及右側(cè)股靜脈插管(PE-50)。右側(cè)股動脈用于監(jiān)測血壓,左側(cè)股動脈用于放血,右側(cè)股靜脈用于復(fù)蘇。所有外科操作均在無菌條件下進(jìn)行。外科操作結(jié)束后經(jīng)過15 min穩(wěn)定期,記錄基礎(chǔ)平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)。建立模型時(shí),通過左側(cè)股動脈插管在10 min內(nèi)抽血使MAP降至40 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。抽出的血液儲存在肝素化(7.5 U/ml)的無菌注射器內(nèi),置于4℃冰箱中,待復(fù)蘇時(shí)回輸至大鼠體內(nèi)。在休克觀察的90 min內(nèi)通過繼續(xù)抽血或少量回輸抽出的血液維持大鼠MAP在40~45 mmHg。休克90 min結(jié)束后,將抽出的血液及等體積生理鹽水在10 min內(nèi)通過右側(cè)股靜脈用微量輸液泵回輸至大鼠體內(nèi),連續(xù)觀察180 min。各組大鼠在外科操作結(jié)束后持續(xù)測量直腸溫度,若直腸溫度<37℃即開始用紅外線燈照射大鼠腹部,A組和B組在實(shí)驗(yàn)觀察期間通過間斷照射紅外線燈維持大鼠直腸溫度在37℃~38℃,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。C組在復(fù)蘇期間通過在大鼠腹部涂抹乙醇及吹冷風(fēng)的方法在5 min內(nèi)將大鼠直腸溫度降至33℃~34℃,在復(fù)蘇觀察的180 min內(nèi)持續(xù)監(jiān)測直腸溫度,若直腸溫度>34℃將繼續(xù)涂抹乙醇及吹冷風(fēng)以維持直腸溫度在33℃~34℃,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

    1.3 標(biāo)本留取 在失血性休克復(fù)蘇180 min后處死大鼠,留取大鼠雙肺下葉組織標(biāo)本各4塊,重1 g,置于-80℃低溫冰箱待測。

    1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) RNA提取:TRIzol一步法提取RNA。反轉(zhuǎn)錄:采用大連寶生物工程大連有限公司試劑盒合成cDNA,反應(yīng)條件:37℃、15.0 min;85℃、5 sed。PCR擴(kuò)增,PGC-1引物序列:上游5′-CAGCCCTCTTCATCTCCAAG-3′,下游5′-TCGTGCAGGTCATCAAGAAG-3′;actin引物序列:上游5′-TCATCACCATTGGCAATGAG-3′,下游5′-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3′。PCR反應(yīng)按下列條件循環(huán):95℃、0.5 min,預(yù)變性,然后95℃、30 s,60℃、34 s,進(jìn)行40個循環(huán)后,60℃、1 min延伸。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,熒光定量PCR儀自動分析并計(jì)算結(jié)果,按2-△△CT法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)水平。

    1.5 蛋白免疫印跡法 采用蛋白免疫印跡法檢測PGC-1蛋白表達(dá)。肺組織加入5倍體積預(yù)冷的細(xì)胞裂解液,冰浴下勻漿,再用冰水浴超聲粉碎。4℃、12 000 r/min離心1 h取上清液,考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。SDS-PAGE分離樣品(40 μg)后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上,封閉后,加入一抗(PGC-1,1∶500)室溫下免疫沉淀1 h,搖洗后加入標(biāo)記二抗(1∶2 000),室溫下作用2 h。ECL浸膜,顯影。照片在圖像分析儀上進(jìn)行分析定量,記錄相應(yīng)蛋白條帶的平均光強(qiáng)度值,計(jì)算PGC-1和actin吸光度值的比值。

    1.6 活性氧檢測 1 g肺組織勻漿后應(yīng)用清潔液漂洗,再以300 r/min離心5 min。將組織沉淀依據(jù)試劑盒說明書處理后,用熒光分光光度計(jì)檢測活性氧水平。

    1.7 肺三磷酸腺苷檢測 將20 mg肺組織用組織裂解液裂解后,以12 000 r/min離心10 min,收集上清液。上清液依據(jù)試劑盒說明書處理后,用熒光分光光度計(jì)檢測三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平。

    2 結(jié)果

    2.1 各組肺組織活性氧水平比較 失血性休克復(fù)蘇180 min,A組肺組織活性氧水平為(101.67±6.50),B組為(320.00±11.87),C組為(208.83±8.84)。B組、C組肺組織活性氧水平高于A組,且B組高于C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    2.2 各組肺組織ATP水平比較 失血性休克復(fù)蘇180 min,A組ATP水平為(20.65±2.02),B組為(4.92±0.32),C組為(15.4±1.0)。B組、C組ATP水平低于A組,且B組低于C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    2.3 各組肺組織PGC-1 mRNA表達(dá)量比較 A組大鼠肺組織PGC-1 mRNA表達(dá)量為(1.47±1.22),B組為(0.07±0.05),C組為(0.28±0.07)。B組、C組PGC-1 mRNA表達(dá)量低于A組,且B組低于C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    2.4 各組肺組織PGC-1蛋白比較 B組、C組PGC-1蛋白低于A組,且B組低于C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

    圖1 各組大鼠肺組織PGC-1蛋白變化

    3 討論

    失血性休克患者易出現(xiàn)自發(fā)性低體溫,對機(jī)體重要臟器功能及內(nèi)環(huán)境平衡產(chǎn)生不利影響,是預(yù)后不良的標(biāo)志[6]。有研究報(bào)道,誘導(dǎo)性低溫可保護(hù)重要臟器功能,提高復(fù)蘇效率,降低病死率[7]。因此,有計(jì)劃的治療性低溫或誘導(dǎo)性低溫復(fù)蘇可以對失血性休克的治療發(fā)揮積極作用。

    活性氧主要是線粒體有氧呼吸過程中的呼吸鏈副產(chǎn)物[8]。有研究認(rèn)為,失血性休克時(shí),機(jī)體在多種強(qiáng)烈因素作用下,體內(nèi)活性氧生成增加,活性氧水平變化可以作為預(yù)測失血性休克早期肺損傷的標(biāo)志物[9]。本研究結(jié)果顯示,失血性休克常溫復(fù)蘇后大鼠肺組織活性氧水平顯著升高,與常溫復(fù)蘇組比較,低溫復(fù)蘇后大鼠肺組織活性氧水平明顯下降。短時(shí)間內(nèi)大量積聚的活性氧會對線粒體的能量代謝呼吸鏈具有顯著損傷、破壞及毒性作用,進(jìn)而導(dǎo)致線粒體腫脹,ATP迅速減少,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10]。B組大鼠肺組織內(nèi)ATP水平明顯下降,而C組ATP水平明顯高于B組(P<0.05),提示失血性休克后采取誘導(dǎo)性低溫復(fù)蘇降低了大鼠肺組織活性氧水平,進(jìn)而改善了線粒體的功能,提高了大鼠肺組織ATP水平,促進(jìn)了能量代謝平衡。

    PGC-1作為重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,可結(jié)合多種轉(zhuǎn)錄因子,增強(qiáng)靶基因轉(zhuǎn)錄效率,廣泛參與多種代謝通路的調(diào)節(jié)活動[11],在適應(yīng)性產(chǎn)熱、線粒體生成、脂肪酸氧化等過程中有著重要作用[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn),正常大鼠肺組織內(nèi)有PGC-1的表達(dá),失血性休克復(fù)蘇后大鼠肺組織PGC-1 mRNA表達(dá)明顯降低,PGC-1蛋白水平也相應(yīng)降低,而C組大鼠肺組織PGC-1 mRNA的表達(dá)被明顯上調(diào),PGC-1蛋白水平也有所升高,提示失血性休克后的誘導(dǎo)性低溫復(fù)蘇能夠上調(diào)大鼠肺組織PGC-1基因和蛋白的表達(dá)。PGC-1是線粒體生理代謝的重要調(diào)控因子,PGC-1的活性增加,能夠刺激線粒體的生物合成,進(jìn)而加速了ATP的生成[14]。也有研究證實(shí),PGC-1可以調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性,減少活性氧的含量,發(fā)揮抗氧化作用[15]。

    綜上所述,誘導(dǎo)性低溫復(fù)蘇失血性休克能夠調(diào)控PGC-1表達(dá)水平,進(jìn)而調(diào)節(jié)ATP和活性氧的水平,減輕肺損傷程度,利于休克的救治。但目前尚不清楚誘導(dǎo)性低溫調(diào)控PGC-1表達(dá)的具體機(jī)制,仍需進(jìn)一步的深入研究。

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