參麥方對心肌細(xì)胞糖脂毒性損傷的保護(hù)作用

關(guān)婉辰 戴璐彬 張棟 周凱旋 劉佳 鮑慧瑋 李麗靜 (長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117)

老年2型糖尿病(T2DM)患病率逐年增加〔1〕，因此對于糖尿病的改善和控制已勢不可擋。T2DM患者常伴有血糖血脂代謝異常，導(dǎo)致長期高血糖和高血脂在體內(nèi)堆積，產(chǎn)生的糖脂毒性對機(jī)體多組織器官造成損傷，其中對心肌功能的危害最大，為研究天然藥物改善糖脂毒性損傷的發(fā)病機(jī)制，本文選用古典名方參麥方進(jìn)行研究，參麥方中人參和麥冬可等分同用，都能益氣養(yǎng)陰，潤肺清心〔2〕，參麥方注射劑型已被臨床證實(shí)能改善T2DM大鼠的心功能〔3〕，為模擬細(xì)胞在體內(nèi)高糖高脂環(huán)境和出于對用藥的長期性考慮，本研究選用參麥方口服劑型在體外建立H9C2細(xì)胞糖脂損傷模型，探討參麥方對大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 H9C2大鼠心肌細(xì)胞：北京協(xié)和細(xì)胞資源中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物

1.2.1參麥方含藥血清制備 15只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組、參麥方低、高劑量組，每組5只?？瞻捉M給予蒸餾水，參麥方低、高劑量組分別按照1.1 g/kg、5.4 g/kg給予自制參麥方水煎液灌胃，連續(xù)3 d，3次/d，末次給藥1 h后，20%烏拉坦麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心取上清液，滅活過濾備用。

1.2.2主要溶液制備 棕櫚酸溶液：取10 ml超純水勻速加入0.209 g棕櫚酸鈉，水浴加熱至70℃溶解，即配制成0.075 mol/L 棕櫚酸水溶液，同時(shí)在30 ml超純水中加入6 g牛血清白蛋白(BSA)緩慢攪拌加熱至完全溶解，配制 20%的BSA水溶液，將3 ml 0.075 mol/L棕櫚酸水溶液緩慢滴加到20%BSA水溶液中，70℃加熱攪拌，充分交聯(lián)后，制成7.5 mmol/L的棕櫚酸溶液，迅速使用0.22 μm濾膜過濾除菌，放于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。葡萄糖溶液：稱取1.8 g葡萄糖，吹打溶解于超純水中，制備成1 mol/L的葡萄糖儲(chǔ)備液，在超凈臺(tái)中使用0.22 μm濾膜過濾除去細(xì)菌和雜質(zhì)，分裝后保存于4℃冰箱。

1.3主要材料與試劑 人參(批號(hào)：200301，北京同仁堂健康藥店)、麥冬(批號(hào)：20190301，北京同仁堂健康藥店)、棕櫚酸(批號(hào)：SLBD2406V，Sigma公司)、葡萄糖(批號(hào)：D9434，Sigma公司)、乳酸脫氫酶試劑盒(批號(hào)：20190523，南京建成生物工程研究所)、Hoechst33258染色試劑盒(批號(hào)：1224192009-08，碧云天)。

1.4H9C2細(xì)胞糖脂毒性模型的建立 H9C2細(xì)胞接板培養(yǎng)后，加入不同濃度梯度的棕櫚酸(0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.75、1.00 mmol/L)和葡萄糖(10、20、30、40、50 mmol/L)，并設(shè)立正常對照組，干預(yù)24 h后，每孔加入10 μl CCK8，1 h后450 nm波長下檢測每孔OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率，選取棕櫚酸與葡萄糖最適殺傷濃度，建立H9C2糖脂毒性模型。同等方法加入不同濃度梯度的參麥注射液(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/ml)計(jì)算細(xì)胞存活率，選取參麥注射液的最適給藥劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5H9C2細(xì)胞糖脂毒性損傷的檢測

1.5.1參麥方含藥血清對糖脂毒性損傷的H9C2細(xì)胞存活率影響 H9C2細(xì)胞以體積100 μl/孔,密度5×103個(gè)/孔，“蛇形順序”接種在96孔板中，使用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，24 h后棄培養(yǎng)液，分組給藥，細(xì)胞分為正常對照組(含10%空白大鼠的血清的DMEM高糖培養(yǎng)液)、糖脂模型組(10%空白大鼠血清+0.40 mmol/L棕櫚酸和30 mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培養(yǎng)液)、參麥注射液組(10%空白大鼠血清+0.40 mg/ml參麥注射液)、參麥方低劑量組(10%參麥方低劑量大鼠血清+0.40 mmol/L棕櫚酸和30 mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培養(yǎng)液)、參麥方高劑量組(10%參麥方高劑量大鼠血清+0.40 mmol/L棕櫚酸和30 mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培養(yǎng)液),給藥干預(yù)后酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞存活率。

1.5.2磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、磷酸化(p)-蛋白激酶B(AKT)/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)檢測 Western印跡檢測蛋白PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR。最終以內(nèi)參GAPDH的灰度值比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5.3形態(tài)學(xué)觀察H9C2細(xì)胞凋亡 細(xì)胞接種6孔板給藥處理后，按 Hoechst 33258 試劑盒方法每孔加入150 μl 5 μg/ml染色液進(jìn)行避光染色，最終使用熒光顯微鏡觀察拍照。

1.5.4H9C2細(xì)胞的凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、活性半胱天冬酶(Cleaved-Caspase)3表達(dá)檢測 同1.5.2方法檢測凋亡蛋白Cleaved-Caspase3、Bax、Bcl-2。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1H9C2細(xì)胞糖脂毒性模型的建立

2.1.1H9C2細(xì)胞脂毒性濃度篩選 與正常對照組相比，棕櫚酸組存活率呈劑量依賴性下降，其中0.40 mmol/L棕櫚酸組存活率達(dá)69.4%，損傷程度可緩，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性穩(wěn)定，因此選用0.40 mmol/L棕櫚酸來建立脂毒性損傷模型。見表1。

表1 棕櫚酸最適濃度篩選

2.1.2H9C2細(xì)胞糖毒性濃度篩選 與正常對照組比較，葡萄糖組存活率呈劑量依賴性下降，30 mmol/L條件下葡萄糖損傷可緩，因此選用30 mmol/L葡萄糖來建立糖毒性損傷模型。見表2。

表2 不同高糖濃度下?lián)p傷H9C2心肌細(xì)胞存活率的影響

2.1.3參麥注射液給藥濃度篩選 與正常對照組相比，參麥注射液組在0.4 mg/ml條件下，H9C2細(xì)胞存活率最高(P<0.01)。見表3。因此選用0.4 mg/ml濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表3 參麥注射液對H9C2心肌細(xì)胞存活率的影響

2.2參麥方含藥血清對H9C2細(xì)胞糖脂毒性模型存活率的影響 與正常對照組比較，糖脂模型組存活率降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與糖脂模型組比，各給藥組存活率顯著上升(P<0.01或P<0.05)，初步說明參麥方對糖脂毒性損傷的心肌細(xì)胞具有改善作用。見表4。

2.3形態(tài)學(xué)觀察H9C2細(xì)胞凋亡 正常對照組細(xì)胞核有序勻稱排布，核邊緣柔和光滑散發(fā)淡藍(lán)色光；與正常對照組比，糖脂模型組核大小不一，可見較多固縮，部分細(xì)胞核成片狀分開，胞核染色加深，可見明顯玻珠樣病變；與糖脂模型組相比，各給藥組細(xì)胞核玻珠樣病變減弱呈淡藍(lán)色光，核收縮情況緩解，說明糖脂毒性可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，經(jīng)參麥方含藥血清干預(yù)后可改善細(xì)胞凋亡。見圖1。

2.4H9C2細(xì)胞的PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)檢測 與糖脂模型組相比，各給藥組PI3K、p-AKT/AKT蛋白明顯升高，p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01或P<0.05)；說明參麥方含藥血清可能調(diào)控了PI3K/AKT/mTOR通路。見表4、圖2。

表4 參麥方對糖脂毒性模型存活率、PI3K/AKT/mTOR通路蛋白及凋亡蛋白表達(dá)的影響

圖1 參麥方含藥血清Hoechst33258染色后H9C2細(xì)胞生長狀態(tài)(×200)

2.5H9C2細(xì)胞的Cleaved-Caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)檢測 與糖脂模型組相比，各給藥組抗凋亡蛋白Bcl-2顯著升高(P<0.05，P<0.01)，促凋亡蛋白Bax和Cleaved-Caspase3表達(dá)水平顯著下降(P<0.05，P<0.01)，說明參麥方含藥血清可減緩心肌細(xì)胞凋亡，改善心肌功能。見表4、圖3。

1～5：正常對照組，糖脂模型組，參麥注射液組，參麥方低劑量組，參麥方高劑量組；圖3同圖2 參麥方含藥血清對H9C2細(xì)胞糖脂毒性模型PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表達(dá)

圖3 參麥方含藥血清對H9C2細(xì)胞糖脂毒性模型凋亡蛋白表達(dá)

3 討 論

T2DM是一種代謝紊亂性疾病，與年齡的影響有著不可分割的關(guān)系，年齡的增長導(dǎo)致糖尿病高發(fā)，對于老年人生活習(xí)慣干預(yù)可減緩糖尿病前期發(fā)展〔4〕，但未能解決根本問題，因此需探求天然藥物討論其作用機(jī)制減緩糖尿病的產(chǎn)生和發(fā)展。因此本文從糖脂毒性角度出發(fā)，對參麥方改善糖脂損傷對心肌細(xì)胞的影響進(jìn)行探究。

目前最為公認(rèn)的使細(xì)胞造成脂毒性損傷應(yīng)用最廣泛的分子是棕櫚酸〔5～12〕，因此本研究中給予棕櫚酸酯和葡萄糖刺激，建立心肌細(xì)胞糖脂損傷模型，通過細(xì)胞毒CCK8檢測存活率，并通過形態(tài)學(xué)染色觀察細(xì)胞凋亡情況，最終發(fā)現(xiàn)經(jīng)參麥方干預(yù)后心肌細(xì)胞凋亡減少。而心肌細(xì)胞受損的同時(shí)發(fā)生的多種特征不僅包括細(xì)胞凋亡和壞死，還包括自噬。自噬和凋亡之間的平衡維持體內(nèi)平衡。自噬的失活可能導(dǎo)致異常蛋白質(zhì)和細(xì)胞器積聚，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡或壞死。 所以自噬和凋亡在心肌細(xì)胞生長過程扮演重要作用〔13〕。研究發(fā)現(xiàn)，在中藥活性成分干擾下能使心臟組織PI3K蛋白上調(diào)，從而激活PI3K/AKT通路，達(dá)到對糖尿病大鼠心肌損傷的保護(hù)作用，其下游mTOR蛋白磷酸化可影響細(xì)胞自噬凋亡等生物活動(dòng)〔14,15〕，Bcl-2是抗凋亡蛋白,Bax是促凋亡蛋白，這兩個(gè)蛋白可互相協(xié)同發(fā)揮作用，對心肌細(xì)胞凋亡起著決定性作用,Caspase3是凋亡執(zhí)行因子之一，是凋亡通路的必經(jīng)途徑，活化的Caspase3被激活可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡,三者對T2DM狀態(tài)下造成的心臟損傷引起的心肌細(xì)胞凋亡有著關(guān)鍵作用〔16,17〕。參麥方是中國傳統(tǒng)的中藥復(fù)方，具有很好的抗凋亡作用，但是參麥方抗凋亡作用的機(jī)制尚不明確。因此通過參麥方干預(yù)后對大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行蛋白檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組比較，各給藥組PI3K、AKT/p-AKT蛋白上調(diào)，p-mTOR/mTOR蛋白下調(diào)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)與模型組比較，各給藥組促凋亡蛋白下調(diào)，抗凋亡蛋白上調(diào)。

綜上所述，參麥方可能通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR 通路促進(jìn)自噬產(chǎn)生從而抑制凋亡，改善心肌細(xì)胞損傷，從而起到對糖脂毒性損傷的心肌細(xì)胞保護(hù)作用，也為后續(xù)深入研究參麥方影響心肌細(xì)胞自噬和凋亡的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。