表達諾如病毒衣殼蛋白的重組腺病毒疫苗的構(gòu)建及其免疫原性分析

王金冬，馬亞林，毛彤瑤，段招軍

中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京 102206

諾如病毒（norovirus，NoV）屬于杯狀病毒科 （Caliciviridae）諾如病毒屬（Norovirus），是一類無包膜的單正鏈RNA病毒，也是導(dǎo)致病毒性急性胃腸炎（acute gastroenteritis，AGE）的重要病原體之一。NoV基因全長約為7 500個核苷酸，包括3個開放閱讀框（open reading frame，ORF）［1］。ORF1編碼6種非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structural protein，NSP），參與病毒的復(fù)制過程。ORF2編碼主要衣殼蛋白VP1，該蛋白相對分子質(zhì)量約為59 000，可自組裝產(chǎn)生在形態(tài)和抗原性上與天然病毒粒子相似的病毒樣顆粒（virus like particles，VLP）［1］。VP1由S區(qū)和P區(qū)兩個結(jié)構(gòu)域組成，S區(qū)主要參與二十面體衣殼的形成，P區(qū)構(gòu)成衣殼外的突起部分，包含NoV主要中和位點，可與組織血型抗原（histo-blood group antigen，HBGA）受體和抗體結(jié)合［2］。ORF3編碼次要結(jié)構(gòu)蛋白VP2，該蛋白可能與病毒的組裝以及維持衣殼蛋白穩(wěn)定性有關(guān)［1］。

NoV可感染多個年齡階段的人群，特別是5歲以下的嬰幼兒。在輪狀病毒疫苗得到大范圍推廣的發(fā)達地區(qū)，NoV感染已成為兒童病毒性胃腸炎的最主要病因［3］。目前，NoV被分成10個基因組（GⅠ~GⅩ），其中大多數(shù)的人類感染與GⅠ和GⅡ病毒株有關(guān)，特別是GⅡ.4，是過去幾十年最主要的流行株，造成50%~70%的暴發(fā)［4］。GⅡ.4 NoV具有高度變異性，每2~4年就會出現(xiàn)新的變異株，取代以往的優(yōu)勢流行株。GⅡ.4 sydney株為一種新的變異株，2012年首次出現(xiàn)于澳大利亞，其后在世界多個國家和地區(qū)造成大規(guī)模暴發(fā)流行，也是我國近年來最常見的報告毒株［5］。

由于缺乏有效的藥物和治療手段，疫苗的推廣和使用是控制NoV感染最有效的方式。但NoV疫苗的研發(fā)目前存在較多困難，原因之一是缺乏細胞培養(yǎng)系統(tǒng)和廣泛可用且成功的動物模型，導(dǎo)致減毒活疫苗、滅活疫苗等傳統(tǒng)疫苗的研究受阻，同時限制了非傳統(tǒng)疫苗的研發(fā)和后續(xù)評價。近期有研究發(fā)現(xiàn)，人類NoV可在B細胞和人腸道干細胞分化的腸上皮細胞（human intestinal enteroid，HIE）中進行培養(yǎng)，但由于病毒復(fù)制效率過低，該技術(shù)目前尚不能用于疫苗研發(fā)［6］。因此，NoV疫苗的研究方向主要集中在VLP、P顆粒等亞單位疫苗以及重組腺病毒載體疫苗等［7-9］。其中研究最為深入的是VLP疫苗，目前已有多家公司和機構(gòu)的研究成果進入臨床實驗階段［9-10］。復(fù)制缺陷的5型腺病毒（HAdV5）載體是開發(fā)新型強效疫苗最有前途的平臺之一，具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，免疫效果好等優(yōu)點［11-12］。HAd5雖然不是腸道病毒，但其易于在人類和其他物種中傳遞，且具有誘導(dǎo)黏膜免疫的潛力，具有廣闊的應(yīng)用前景［11］。美國Vaxart公司目前正在研發(fā)一種基于HAd5載體的口服NoV重組腺病毒疫苗，該疫苗使用雙鏈RNA作為佐劑，能有效提高體液免疫和黏膜免疫水平［13］。該研究目前已進入臨床階段。

本研究以HAd5為載體，構(gòu)建包含ORF2（VP1）、ORF3（VP2）和3′UTR區(qū)的新型重組腺病毒載體疫苗，并與單獨表達VP1的重組腺病毒疫苗進行對比，評價新型疫苗誘導(dǎo)小鼠體液、黏膜和細胞免疫應(yīng)答的能力。

1 材料與方法

1.1質(zhì)粒、病毒及細胞 攜帶NoVGⅡ.4 sydney 2012（GenBank：OK148516）VP1、VP2和3′UTR區(qū)的質(zhì)粒（puc-VP1-2）由金唯智生物科技有限公司合成；純化后的NoV GⅡ.4 P顆粒由中國疾病預(yù)防控制中心病毒性腹瀉室提供；改良后的腺病毒載體pkAd5ES和HEK293細胞株由中國疾病預(yù)防控制中心洪院士實驗室魯茁壯老師惠贈。

1.2實驗動物 BALB/c小鼠18只，雌性，6～8周齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號：110011211109361851。本實驗均以科研為目的對小鼠進行養(yǎng)殖和使用，且按照中國疾控中心病毒病預(yù)防控制所動物倫理相關(guān)規(guī)定進行（20201020058）。

1.3主要試劑及儀器 常用限制性內(nèi)切酶和同源重組酶購自美國New England Biolab公司；RIPA細胞裂解液購自碧云天生物技術(shù)公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipfectamine 3000為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；2×Trans-Start?FastPfu Fly PCR SuperMix、HRP標記的羊抗小鼠IgG、羊抗兔IgG和抗β-actin小鼠單克隆抗體購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；諾如病毒VP1和VP2兔源多克隆抗體購自美國GeneTex公司；HRP標記的羊抗小鼠IgA和鏈霉親和素購自美國Abcam公司；聚丙烯酰胺（PPA）-biotin標記的H雙糖購自新西蘭GlycoNZ公司；小鼠淋巴細胞分離液、小鼠IFNγELISPOT檢測試劑盒和小鼠IL-4 ELISPOT檢測試劑盒購自達科為生物技術(shù)股份有限公司；自動細胞計數(shù)儀Countess3購自美國Thermo公司。

1.4重組腺病毒的構(gòu)建 以puc-VP1-2質(zhì)粒為模板，分別擴增VP1（含CMV啟動子）和VP1+VP2+3′UTR（含CMV啟動子）序列。利用Primer Premier 5軟件設(shè)計引物，VP1上游引物：5′-ATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGC-3′，下游引物：5′-TATCTAGATCCGGTGGATCGGATATCGTTTTCACAGGGCTCTTCTTCTG-3′；VP1+VP2+3′UTR區(qū)上游引物與VP1同，下游引物：5′-CTATCTAGATCCGGTGGATCGGATATCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAGACA-3′。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃20 s，62℃20 s，72℃40 s，共35個循環(huán)；72℃延伸5 min后，電泳回收目的片段。將兩種PCR擴增產(chǎn)物通過同源重組的方式分別插入改造后的pkAd5ES腺病毒載體中，獲得兩種重組腺病毒質(zhì)粒。在外源基因插入位點兩端設(shè)計1對通用引物，對重組質(zhì)粒進行PCR鑒定。上游引物：5′-TTGGGCGTAACCGAGTAAGA-3′，下游引物：5′-AATTGCATTCATTTTATGTTTCAG-3′。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃20 s，50℃20 s，72℃40 s，共35個循環(huán)；72℃延伸5 min。將擴增片段送至北京擎科生物科技有限公司測序。使用Lipfectamine 3000將鑒定正確的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞，7～10 d后觀察細胞病變情況。重組腺病毒經(jīng)大量擴增后，采用氯化銫密度梯度離心法進行純化，TCID50法測定病毒滴度。

1.5外源基因表達的鑒定 將HEK293細胞按2×105個/孔接種6孔板，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。分別感染純化后等劑量的pkAd5ES、pkAd5ESVP1和pkAd5ES-VP1-2重組腺病毒。感染48～72 h待細胞完全病變后收集細胞，各加入100μL RIPA裂解液，冰上放置2 min，13 000×g離心5 min，取上清，采用Western blot法檢測VP1和VP2在細胞中的表達情況：將處理后的蛋白樣品經(jīng)12%SDSPAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入諾如病毒VP1、VP2兔源多克隆抗體（均1∶1 000稀釋）和抗β-actin小鼠單克隆抗體（1∶2 000稀釋），室溫孵育1 h；PBST洗滌3次，分別加入HRP標記的羊抗兔和羊抗小鼠IgG（1∶2 000稀釋），室溫孵育1 h；ECL發(fā)光試劑盒曝光顯色。

1.6動物免疫及標本采集 將小鼠隨機分為3組：對照組（pkAd5ES）、VP1組（pkAd5ES-VP1）和VP1-2組（pkAd5ES-VP1-2），每組6只。禁食12 h后給予100μL重組腺病毒，108IU/只。所有小鼠均采用灌胃給藥。共免疫2次，間隔3周，每次免疫前采集小鼠血液和糞便，進行特異性IgG和IgA抗體檢測。加強免疫2周后處死小鼠，采集血液、糞便和脾臟，進行ELISA和ELISPOT檢測。

1.7小鼠血清特異性IgG和IgA抗體檢測 采用ELISA法。將小鼠血液樣本室溫靜置1～2 h，3 000×g離心20 min分離血清，待檢。取小鼠新鮮糞便樣本，按照10%（W/V）加入無菌PBS，13 000×g離心10 min，取糞便上清待檢。將純化的NoV GⅡ.4 P顆粒加入ELISA板中，4℃包被過夜；PBST洗板3次，以5%脫脂奶粉于37℃封閉1 h；加入倍比稀釋的待測血清或糞便上清，同時以免疫前小鼠血清或糞便上清作為陰性對照，進行同比例稀釋，37℃孵育1 h；加入HRP標記的羊抗鼠IgG或IgA（1∶10 000稀釋），37℃孵育1 h；洗板后加入TMB顯色液，室溫避光作用10 min；加入1 mol/L磷酸終止反應(yīng)，于酶標儀450 nm波長處測定吸光度值。樣本孔A450值高于陰性對照孔2.1倍以上，且大于0.2判為陽性，陽性孔所對應(yīng)最大稀釋倍數(shù)為抗體效價。將陰性血清（IgG滴度＜20）和糞便樣本（IgA滴度＜5）分別判為1和0，以用于統(tǒng)計學(xué)分析。

1.8HBGA結(jié)合阻斷試驗 將純化的GⅡ.4 P顆粒加入96孔板中，4℃包被過夜；加入5%脫脂奶粉，37℃封閉2 h；PBST洗板后，將小鼠血清2倍系列稀釋，加入板中，37℃孵育1 h，同時設(shè)未加血清阻斷的孔作為對照；加入聚丙烯酰胺（PPA）-biotin標記的H雙糖，4℃反應(yīng)過夜；加入HRP標記的鏈霉親和素（1∶2 000稀釋），37℃孵育1 h；TMB避光顯色10 min；1 mol/L磷酸終止反應(yīng)，酶標儀讀取波長450 nm的吸光度值。比較小鼠血清封閉前后的A450值。阻斷效價50%（BT50）指加入血清后能使NoV P顆粒與寡糖的結(jié)合效率下降50%，即與未加血清阻斷的對照組相比，A450值下降至少50%的最高血清稀釋度［14］。

1.9小鼠脾臟淋巴細胞IFNγ和IL-4水平的檢測 采用ELISPOT法。采用頸椎脫臼法處死小鼠，取出脾臟，用小鼠淋巴細胞分離液分離脾淋巴細胞，在自動細胞計數(shù)儀Countess3上進行活細胞計數(shù)。按照試劑盒說明書進行ELISPOT操作：將細胞按4×105個/孔鋪板，加入GⅡ.4特異性刺激物刺激培養(yǎng)24 h；用冰冷的去離子水裂解細胞，重復(fù)洗滌后加入生物素標記的抗體（1∶1 000稀釋），37℃孵育1 h；洗板后再加入HRP標記的酶標親和素（1∶1 000稀釋），37℃作用1 h；加入配置好的AEC顯色液，室溫避光靜置5～30 min；根據(jù)斑點生成情況選擇終止顯色時間，對陽性斑點計數(shù)。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 使用GraphPad Prism 8軟件的One-way ANOVA對實驗數(shù)據(jù)進行分析?？贵w滴度取對數(shù)后進行統(tǒng)計學(xué)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1重組腺病毒的包裝及外源基因表達的鑒定

2.1.1重組腺病毒質(zhì)粒的PCR鑒定 1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，pkAd5ES、pkAd5ES-VP1和pkAd5-ES-VP1-2的PCR擴增產(chǎn)物分別可見178、2 944和3 820 bp的目的條帶，大小均與預(yù)期相符，見圖1。

圖1 pkAd5ES-VP1和pkAd5ES-VP1-2的PCR鑒定Fig.1 Identification of pkAd5ES-VP1 and pkAd5ES-VP1-2 by PCR

2.1.2病毒滴度 經(jīng)大量擴增和純化后，重組腺病毒pkAd5ES-VP1和pkAd5ES-VP1-2以及pkAd5ES（空載體）的病毒滴度分別為3.4×109、2.4×109和5×109IU/mL。

2.1.3VP1和VP2外源基因表達的鑒定 Western blot分析顯示，pkAd5ES-VP1和pkAd5ES-VP1-2感染細胞中均可檢出VP1蛋白條帶，大小約59 000，但兩者的表達量無明顯差異；VP2蛋白條帶僅在pkAd5ES-VP1-2感染細胞中檢出。提示兩種重組病毒均能在真核細胞中高效表達外源基因。見圖2。

圖2 Western blot分析重組腺病毒感染HEK293細胞后VP1和VP2的表達情況Fig.2 Western blotting of expressions of VP1 and VP2 in HEK293 cells infected with recombinant adenoviruses

2.2小鼠血清特異性IgG和IgA抗體滴度 ELISA結(jié)果顯示，灌胃2周后，VP1和VP1-2組小鼠血清VP1特異性IgG抗體滴度約為102，顯著高于對照組（P分別為0.020 8和0.043 4）；加強免疫后，試驗組與對照組差距進一步加大（P<0.000 1），抗體滴度達103左右。初次免疫和加強免疫后，VP1和VP1-2組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P分別為0.996 6和0.984 1）。初次免疫后，VP1-2組小鼠糞便中IgA抗體水平明顯升高，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000 1）；加強免疫后，試驗組IgA抗體水平進一步升高，且VP1-2組明顯高于VP1組（P=0.005 7）。見圖3。

圖3 灌胃后各組小鼠體內(nèi)VP1特異性IgG（A）和IgA（B）抗體水平的變化Fig.3 VP1-specific IgG（A）and IgA（B）antibody levels in mice in various groups after oral immunization

2.3HBGA s阻斷試驗 VP1-2組小鼠血清抗體對GⅡ.4 P顆粒與寡糖結(jié)合的阻斷效價（BT50＞50）明顯高于VP1組（BT50＜10），見圖4。

圖4 灌胃后小鼠血清抗體對P顆粒與HBGA結(jié)合的阻斷效果Fig.4 Blocking effect of serum antibody on binding of P particles to HBGA of mice after oral immunization

2.4小鼠脾臟淋巴細胞IFNγ和IL-4水平ELISPOT結(jié)果顯示，與VP1組比較，VP1-2組小鼠脾臟淋巴細胞內(nèi)VP1特異性IFNγ和IL-4分泌細胞的數(shù)量明顯增多，特別是IL-4（P=0.016 7），見圖5。

圖5 小鼠脾臟淋巴細胞內(nèi)IFNγ（A）和IL-4（B）分泌水平的變化Fig.5 Levels of IFNγ（A）and IL-4（B）in spleen lymphocytes of mice

3 討論

在所有疫苗分類中，減毒活疫苗能夠提供最有效持久的免疫保護，但由于NoV難以進行體外培養(yǎng)，導(dǎo)致減毒活疫苗、滅活疫苗等傳統(tǒng)疫苗的研發(fā)受限，而病毒載體疫苗提供了一種類似活疫苗的方法，為高效NoV疫苗的開發(fā)提供了思路。非復(fù)制型Ad5腺病毒載體是一種成熟且安全有效的疫苗平臺，目前已參與了多種重要傳染性疾病疫苗的研發(fā)，如埃博拉、流感、COVID-19等，部分疫苗已在國內(nèi)上市［15-17］。HAd5載體目前面臨的最大問題是預(yù)存免疫（preexisting immunity，PEI）的影響，針對載體的抗體會削弱外源抗原的免疫效果。有研究發(fā)現(xiàn)，黏膜免疫可繞過PEI的影響，誘導(dǎo)針對編碼抗原的顯著免疫反應(yīng)［11，18］。而且黏膜感染是腺病毒的固有特征，重組腺病毒疫苗通過黏膜免疫有望獲得較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。黏膜免疫的途徑有很多種，包括口腔、鼻腔、直腸、結(jié)膜以及陰道，黏膜免疫疫苗研究的關(guān)鍵是選擇合理有效的黏膜免疫途徑［19］?？诜臃N是黏膜免疫的主要方式之一，其具有較好的免疫學(xué)優(yōu)勢和成本效益，包括易接種，能刺激較強的黏膜免疫反應(yīng)，以及誘導(dǎo)強大的系統(tǒng)免疫等，尤其適用于經(jīng)糞口途徑傳播的病原體［20］。但口服免疫同樣會受低pH值、蛋白水解酶和胃腸道環(huán)境中生物屏障的影響，限制疫苗的吸收［20］?？紤]口服疫苗的低效性，可通過增加疫苗免疫劑量來提升免疫效果，但這可能會增加免疫耐受的風(fēng)險。因此，增加疫苗抗原的表達水平或提高其免疫原性是提升口服疫苗效力的重要手段之一。

VP2是ORF3區(qū)編碼的次要結(jié)構(gòu)蛋白，位于病毒衣殼內(nèi)部。該蛋白在杯狀病毒中相對保守，在病毒復(fù)制或組裝中發(fā)揮重要作用。有研究表明，VP2能有效促進NoV VP1的表達，并提高其VLP的穩(wěn)定性，而且可能參與調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)［1］。在載體疫苗中共表達VP1、VP2蛋白以及3′末端的基因調(diào)控序列能夠提高VP1特異性細胞免疫和黏膜免疫反應(yīng)［21］。

本研究以HAd5為載體分別構(gòu)建了包含NoV VP1（pkAd5ES-VP1）以及VP1+VP2+3′UTR區(qū)（pkAd5ESVP1-2）的兩種重組腺病毒載體疫苗，并通過免疫動物比較兩者的免疫原性。兩種重組腺病毒包裝時間為8 d左右，VP2的插入并未影響病毒的包裝效率。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，VP1和VP2蛋白在感染細胞中高效表達，但VP2和3′UTR區(qū)的插入并未顯著增加VP1蛋白的表達量，這與其他研究結(jié)果不符［24］。本研究中VP2對免疫效果的影響可能更多與VP2蛋白本身有關(guān)。兩種重組腺病毒在免疫2周后均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答，加強免疫后血清總IgG水平進一步增強。但無論是初次免疫還是加強免疫，VP1和VP1-2組之間并未出現(xiàn)明顯差異，說明VP2的存在對IgG的提升并無明顯效果。糞便IgA是反應(yīng)黏膜免疫最重要的指標，本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，初次免疫后VP1-2組的IgA抗體水平明顯升高，且加強免疫后進一步增強，VP1-2組顯著高于VP1組，表明VP2能有效促進IgA抗體水平的增高，提升黏膜免疫效果。中和抗體是疫苗評價最關(guān)鍵的指標，但由于NoV難以進行體外培養(yǎng)，中和試驗無法開展，目前多采用HBGAs阻斷試驗替代中和試驗［14］。HBGAs是一類復(fù)雜的碳水化合物，包含巖藻糖的寡聚糖，大量分布于呼吸道、腸道、泌尿生殖道的黏膜上皮細胞以及唾液、血液等體液中。不同的NoV基因型可能結(jié)合不同類型的HBGA。GⅡ.4結(jié)合譜最廣，可結(jié)合大部分HBGA分子，包括H抗原［23］。本實驗通過檢測GⅡ.4 P顆粒與H雙糖的結(jié)合作用是否被阻止，以評價血清抗體的中和效果。試驗結(jié)果表明，在血清總IgG相當?shù)那闆r下，VP1-2組的阻斷效果明顯高于VP1組，表明VP1-2組產(chǎn)生了較多的中和抗體，這可能與VP2蛋白的插入有關(guān)，該蛋白上可能包含某些中和抗原位點，刺激多余中和抗體的產(chǎn)生，但由于VP2主要位于病毒衣殼內(nèi)，該觀點未得到佐證。IFNγ和IL-4水平是反應(yīng)細胞免疫功能的重要指標。本研究通過ELISPOT方法對免疫小鼠的脾臟細胞進行檢測，經(jīng)特異性刺激后，VP1-2組產(chǎn)生的IFNγ和IL-4 SFC的數(shù)量多于VP1組，表明口服免疫中VP2的加入對細胞免疫具有一定的刺激效果。

目前尚無NoV疫苗上市，研究者從不同方面對NoV疫苗進行創(chuàng)新研究，以期獲得更好的免疫效果。本研究將VP1+VP2+3′UTR區(qū)（VP1-2）作為抗原包裝進腺病毒載體中，實驗結(jié)果證實，相對于包裝VP1的重組腺病毒疫苗，VP1-2疫苗在口服免疫時能有效提升IgA、中和抗體以及IL-4水平。VP2是否可作為NoV重組載體疫苗的重要組成，以及采用不同免疫劑量、不同接種方式產(chǎn)生的免疫效果是否存在差異，仍需進一步研究。