杉木低磷脅迫響應研究進展

梁 龍，胡德活，晏 姝，鄭會全，王潤輝，韋如萍*

(1.肇慶市國有大坑山林場，廣東 肇慶 526400；2.廣東省森林培育與保護利用重點實驗室/廣東省林業(yè)科學研究院，廣東 廣州 510520)

在植物正常生長和代謝過程中，磷是必需的大量元素之一，參與了很多重要代謝過程，磷素供應的減少，會使植物代謝延緩，生長發(fā)育受阻。植物生長發(fā)育過程中所需磷素有90%以上來自土壤，并主要以無機磷為主。然而土壤中大部分的無機磷極易被固定，形成非可溶態(tài)磷酸鹽，使得土壤有效磷濃度降低到僅為1～10×10mol/L，遠遠不能滿足植物正常生長發(fā)育所需，因而，生長介質中的有效磷含量成為制約植物產量的主要因素之一。

杉木()是我國重要的速生工業(yè)用材樹種，也是我國南方商品林基地建設的重要支撐樹種，在我國長江流域、秦嶺以南地區(qū)廣泛栽培。杉木栽培區(qū)的土壤以紅壤和黃壤為主，土壤淋溶作用強，鹽基飽和度低，酸度大，鐵、鋁氧化物豐富，土壤中大部分磷素以非可溶態(tài)形式存在，而植物能吸收利用的有效磷濃度常低于10 mg/kg，是典型的“遺傳學缺磷”土壤。土壤的低磷環(huán)境已成為杉木人工林長期生產力維持的關鍵養(yǎng)分供應限制因子，如何解決杉木長期多代連作造成的土壤養(yǎng)分虧缺并防止人工林產量的降低，是我國杉木產區(qū)所面臨的重要問題。為此，探析杉木磷脅迫響應機制，挖掘杉木磷高效利用基因型和開展磷素高效利用育種已成為眾多學者的研究熱點之一。已有的研究表明，低磷脅迫下，杉木植株的生物量累積和分配格局、根系形態(tài)構型、酸性磷酸酶活性、內源激素含量、蛋白質表達等均發(fā)生了一系列的適應性變化。本文從表觀形態(tài)、生理生化、分子機制等角度入手，對低磷脅迫下杉木發(fā)生的系列適應性變化進行總結，以期為杉木磷素高效利用品系選育提供參考。

1 低磷脅迫下杉木的形態(tài)響應特征

植物根系的形態(tài)變化與土壤養(yǎng)分分布有密切關系。低磷脅迫下，為了活化和吸收利用土壤磷素，通過改變根系形態(tài)和根系構型以擴大根系吸收范圍是植物根系在形態(tài)學上的應對機制之一。低磷脅迫常導致大多數植物的根直徑變細、側根和根毛密度增高、根冠比增大、形成植物—菌根真菌的共生體或排根等特異性根形態(tài)。對杉木無性系扦插苗和組培苗的研究表明，相比正常供磷處理，低磷脅迫下杉木的苗高和地莖生長減小，地上部生物量積累降低，根長、根表面積及根體積增加，平均根直徑變小，根冠比增大，這些形態(tài)變化在不同無性系間存在顯著差異。究其原因可能是長時間的低磷脅迫會引起機體代謝紊亂，使碳水化物的合成和運輸受到阻礙，進而對植株地上(莖和葉)和地下部分(根)的生長均造成不利影響；其次是在自身遺傳特性和外界環(huán)境條件的共同影響下，植物根系會產生多樣化的形態(tài)和生理響應，且其響應特征會因植物種類或基因型的不同而差異顯著。研究還表明，杉木磷高效無性系的根系干物質累積量、根系總體積、根系總表面積、根系總長度等均高于磷低效無性系，而且磷高效利用無性系的細根比例顯著增加。

低磷脅迫還會導致杉木根尖和根端皮層組織溶解形成通氣組織，但不同家系間存在一定差異。汪攀研究表明，隨著低磷脅迫程度的加劇，根系皮層組織形成明顯通氣組織的杉木家系，其苗高、地徑呈逐漸增加的變化趨勢，而根系皮層溶解不明顯或尚未出現(xiàn)溶解現(xiàn)象的家系，則隨著低磷脅迫程度的加重，根系增生現(xiàn)象更為明顯。對杉木2個半同胞家系的苗木進行3個月的供磷和缺磷脅迫盆栽試驗，在距根尖40～45 mm的根段中發(fā)現(xiàn)，杉木幼苗根皮層通氣組織的形成在家系和供磷水平之間均有顯著差異，其中，根皮層通氣性較強的家系其根長、根表面積和根徑的增長量較小，根皮層通氣組織與平均根徑和根表面積的增長量呈現(xiàn)出顯著的負相關關系。此外，對杉木根系細胞壁活化鐵磷的能力研究還表明，杉木的根徑級、組織部位及林齡等因子對其根系細胞壁活化鐵磷的影響均較顯著，在同一個根徑級內，從木質部和韌皮部中提取出的細胞壁組織對鐵磷的活化能力大小排序為：老齡林(34年生)>中齡林(22年生)>幼齡林(10年生)，并以根徑級小于 10 mm 的根系對鐵磷的活化能力最高，且根系韌皮部細胞壁的活化能力明顯高于木質部。

葉片性狀是植物適應環(huán)境能力以及復雜生境下自我調控能力的重要形態(tài)反映。與正常供磷處理相比，在低磷脅迫下大豆()的葉面積和新葉發(fā)生率分別減少67%和43%，原因可能是低磷脅迫對細胞分裂素具有不利影響進而抑制了葉表皮細胞的擴展。比葉質量是一個反映植物功能的重要結構參數，也是反映植物環(huán)境應對策略的重要指標，與葉片年齡、單位干物質的氮、磷含量以及單位干物質的最大光合能力等密切相關。為此，比葉質量值已被作為包括磷素營養(yǎng)脅迫在內的植物耐(非)生物脅迫能力的重要評價指標。目前，低磷脅迫下杉木葉片的適應性變化尚未見到報道。

低磷脅迫下植株形態(tài)學的響應特征，已被作為杉木磷素高效基因型篩選的評價依據。吳鵬飛利用低磷脅迫下杉木形態(tài)和生理指標的差異表現(xiàn)，從21個參試杉木無性系中篩選出2個磷素高效利用杉木速生基因型，在磷素匱乏環(huán)境中它們能保持較高的生物量累積速度和磷素利用效率。梁霞等利用類似的方法，從8個扦插繁殖的杉木無性系中篩選出1個磷素吸收和利用效率均較高的無性系，2個磷素吸收效率較高和1個磷素利用效率較高的無性系，并認為低磷脅迫條件下，杉木無性系可通過形態(tài)和生理的適應性變化以提高磷素吸收和利用效率進而提高對環(huán)境磷素的利用。

2 低磷脅迫下杉木的生理響應特性

植物根系可以直接吸收的是土壤溶液中的無機正磷酸鹽，但土壤中磷素的形態(tài)主要分為非可溶態(tài)無機磷和有機磷。據估計，土壤中的磷素大部分以鐵磷、鋁磷和鈣磷等非可溶態(tài)無機磷形式存在，占60%～80%，植酸磷、磷脂和核酸磷等非可溶態(tài)有機磷占20%～40%。通常情況下，這部分的磷源很難被植物直接吸收利用。植物主要通過根際微生物或強化根系質子釋放量、有機酸分泌量、酸性磷酸酶活性(分泌量)及其他化合物的分泌等生理措施來直接或間接地活化土壤中這部分固定態(tài)磷源，進而改變土壤中可溶性有效磷的供給，提高植物對土壤磷的獲取能力。

根系質子的釋放主要是為了維持植物體內的電位平衡。為了平衡過量的陽離子吸收引起的電荷差，由根系質子釋放所介導的根際酸化過程，對植物獲取土壤中非可溶態(tài)磷源具有非常重要的作用。大量研究表明，根系有機酸分泌量的增強是植物對低磷環(huán)境的適應機制之一。研究表明，低磷脅迫可促使杉木根系有機酸的分泌和根際質子的釋放，以活化土壤中的固定態(tài)磷源。在缺磷條件下，杉木種源1年生幼苗根系主要增加草酸、酒石酸、檸檬酸和蘋果酸的分泌，隨缺磷脅迫程度的增加，分泌量也逐漸增加，但不同種源的杉木有機酸的分泌量和種類不同。梁霞的研究顯示，低磷脅迫下，杉木無性系扦插苗培養(yǎng)液中質子釋放量有所提高，而且隨著脅迫時間的延長和脅迫程度的加重，質子釋放量的增加幅度越大，但不同杉木無性系的變化幅度存在差異，表明低磷脅迫下，杉木無性系可通過增加根系質子釋放量引起根際酸化進而提高對土壤磷素的吸收能力。

Wu等還研究了競爭強度、供磷水平、競爭時間對杉木插條的生長及根尖有機酸含量和類型的影響，指出低磷處理和競爭強度導致根系體積明顯增加，兩者的交互作用顯著提高了根尖有機酸濃度，在缺磷和低磷處理(6 mg/kg KHPO)第50天到150天內，根尖有機酸的種類呈逐漸減少趨勢，在兩個供磷處理(6、12 mg/kg KHPO)的根尖中檢測到檸檬酸，但在缺磷處理中未檢測到。進一步研究不同杉木家系在不同供磷處理下根系 H流變化規(guī)律可知，在缺磷處理和中度缺磷(0.5 mmol/L KHPO)處理3 d內，兩個杉木半同胞家系幼苗的根系處于H釋放狀態(tài)，在短期應激反應后H流由外排轉變?yōu)槲?，表明低磷脅迫下杉木幼苗根系H外排是一種應激反應，在酸性培養(yǎng)環(huán)境中，不同杉木家系會通過H內流來適應低磷脅迫。

植物內源激素是植物體內自身代謝產生的新陳代謝的調控者，與植物的應激反應以及形態(tài)學的適應性變化有著密不可分的關聯(lián)性。植物體內激素平衡的改變可能與根系構型的改變及干物質在根系與地上部分之間分配比例的改變有關。對棉花 ()、小麥()的研究表明，組織器官內生長素和細胞分裂素的含量和分布受到氮、鉀等養(yǎng)分供給狀況的顯著影響。相似的，磷的缺乏也使杉木內源激素發(fā)生相應變化。在低磷脅迫下，杉木家系幼苗根系的細胞分裂素含量明顯降低，但生長激素和脫落酸的含量明顯增加，而且不同磷素利用效率的杉木家系內源激素含量與幼苗生長性狀間有不同的相關性，如細胞分裂素含量與低磷素利用效率和高磷素利用效率家系的根冠比分別呈顯著正、負相關性，這可能與不同磷素利用效率的杉木家系幼苗在低磷環(huán)境下根系皮層組織溶解并釋放磷營養(yǎng)的能力有關。汪攀指出，在低磷脅迫條件下，根尖和根端皮層形成明顯通氣組織的杉木家系，其根系的生物量、磷素含量、磷素累積量均逐漸減少，植株地上部生物量、全株磷利用效率則逐漸增加；而根系皮層溶解不明顯或尚未出現(xiàn)溶解現(xiàn)象的家系，則通過根系增生以維持較高的磷素利用效率。

光合作用是植物體最基本的生理過程，為植物生命活動和物質代謝提供原料、能量和碳架，也是作物產量和其他生物生存的基礎。低磷脅迫下，植物生長發(fā)育受抑制的一個決定因素在于，磷對參與C、C植物光合作用的酶，如核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)及其相關過程(如淀粉、蔗糖合成)的影響。當葉綠體中同化物的生產超過了磷酸糖的輸出時，葉綠體基質中磷水平即降低，這種底物的降低抑制了類囊體膜中ATP合成酶活性，減少了Rubisco，導致低磷脅迫下植株葉片中的ATP和NADPH含量明顯下降，進而降低了碳同化作用及整個光合作用。此外，研究還表明，不同磷素效率基因型植物其光合作用受低磷脅迫的影響不同。對杉木無性系扦插苗的研究表明，低磷脅迫下扦插苗的葉綠素含量、凈光合速率均明顯下降，且下降幅度隨脅迫程度的加重而增大，同時，暗呼吸速率呈增加趨勢，CO補償點增大，光呼吸速率增加，說明土壤磷素供應不足嚴重影響了杉木無性系扦插苗的光合作用，且光合特性的變化在不同無性系間存在差異。

3 低磷脅迫下杉木的分子響應機制

植物在低磷脅迫條件下發(fā)生的形態(tài)、生理生化等方面的適應性變化，是由眾多低磷脅迫響應基因協(xié)調表達的結果。研究顯示，磷效率屬于多基因控制的數量性狀，目前已經鑒定的參與感知生長介質中磷酸鹽狀態(tài)和調整適應機制的調節(jié)基因網絡主要包括了轉錄因子、SPX(Syg1、Pho81、XPR1)亞家族蛋白、非編碼RNA和蛋白修飾物(包括參與SUMO化、磷酸化、去磷酸化以及蛋白運輸的各種蛋白)等。Li等以1個磷素高效杉木無性系為材料，對低磷脅迫和正常供磷處理根組織轉錄組進行測序，共獲得3416個差異表達基因，其中607個獲得KEGG通路注釋，涉及206條代謝通路，這些差異表達基因可能與糖酵解/糖異生、光合作用、碳固定、酸性磷酸酶、磷轉運蛋白等相關基因密切相關，并獲得53個與磷代謝、磷吸收和轉運有關的差異表達基因。趙中華以1個耐低磷杉木無性系為材料，獲得了其針葉響應低磷脅迫的差異蛋白圖譜，并指出隨著缺磷脅迫處理時間的延長，差異表達的蛋白點顯著增加，低磷脅迫第10天時，其差異表達的蛋白點為103個，這些差異表達的蛋白質間可能形成了信號傳遞網絡以及互作體系，并對杉木細胞的光合作用、物質代謝等過程進行共同調控。

通常情況下，土壤中可溶性磷濃度為1～10×10mol/L，而植物細胞中磷濃度為5～20×10mol/L，是土壤中可溶性磷濃度的1000倍以上。可見植物對土壤磷素的獲取方式，主要是一個由磷轉運蛋白介導的逆濃度梯度的跨膜主動運輸過程。在植物中，轉運蛋白按照序列相似性可劃分為H/Pi共轉運家族(Pht1家族)和Na/Pi共轉運家族(Pht2家族)兩類。近年來，在水稻()、擬南芥()等多種植物中相繼獲得了高親和磷轉運蛋白基因，同時研究結果還證明了每個物種基因組中磷轉運蛋白基因是一個含有不同數量成員的基因家族。張穎以1個杉木磷高效利用無性系為試驗材料研究指出，杉木基因具有高度保守的MYBCC結構域，是屬于MYBCC轉錄因子家族的新成員；隨著低磷脅迫程度的增加和脅迫時間的延長，基因的表達呈現(xiàn)出動態(tài)的變化規(guī)律；在對過表達株系幼根中的磷轉運蛋白基因的表達進行分析發(fā)現(xiàn)，基因對;、;、;與;的表達具有正調控作用，對;、;的表達不具有調控作用。蘇爍爍使用RACE技術克隆獲得一個杉木磷轉運蛋白基因，命名為;；該基因與PHT1家族基因表達特征相同，主要在杉木的根部表達，并在不同磷利用效率的杉木家系中表達量存在較大差異；在缺磷脅迫下，;基因的表達量明顯升高，正常供磷后表達量明顯降低，且脅迫程度越髙，表達變化越明顯。

植物磷轉運蛋白基因的表達會受到轉錄水平和蛋白質水平的協(xié)同調控。對擬南芥、水稻、棉花等多個植物的研究表明，低磷脅迫下，參與調控植物根系生長的轉錄因子主要包括MYB家族、bHLH家族和WRKY家族等。類似的，在低磷脅迫下杉木根系的生長發(fā)育過程中，可能也受到了這些轉錄因子家族成員的參與調控。曾銘等以杉木無性系“洋061”為材料，從供試杉木苗中提取出原生質體并進行1、3、6、12、24 h 的低磷處理，通過轉錄組數據分析，鑒定出44個杉木基因序列并分為3個大亞家族，發(fā)現(xiàn)亞家族中每組成員都包含保守域及不同的鋅指結構，進一步的qRT-PCR結果顯示，在低磷脅迫下、、、這4個基因可能參與了杉木耐受低磷脅迫的調控過程，但具體調控機理尚不明確。

4 低磷脅迫下杉木—菌根真菌共生體特征

形成植物—菌根真菌共生體系也是植物適應低磷脅迫的主要機制之一。大約80%的陸生植物能被菌根真菌侵染形成共生關系，在生長介質有效養(yǎng)分虧缺的狀況下，菌根真菌可以有效促進共生植物對養(yǎng)分的吸收。研究表明，菌根真菌的侵染可刺激植物根系分泌酸性磷酸酶，提高根際土壤酸性磷酸酶活性，從而促進植株對土壤磷素的活化和吸收，但其分子機制尚不明確。此外，植物與菌根真菌的共生還加強了不同植物間的相互聯(lián)系。與菌根真菌共生之后，植物—真菌—土壤三者之間的聯(lián)系網絡得以建立，不同植物之間的聯(lián)系，可以通過菌絲與土壤養(yǎng)分的競爭實現(xiàn)，還可以通過菌絲網絡進行信號傳導和養(yǎng)分物質的傳遞和交換。目前，對低磷脅迫下杉木—菌根真菌共生體的研究尚處于起步階段，尚未見到從低磷脅迫下杉木植株中分離、提取、研究內生真菌的相關報道，已有的少量研究僅集中在外源添加內生真菌菌株對低磷脅迫下杉木植株形態(tài)生理指標的影響。研究表明，低磷脅迫下杉木幼苗分別接種無柄盤菌屬sp.(NG1)，毛霉屬sp.(CG5)，擬青霉屬-sp.(AJ6)，絲葚霉屬sp.(AJ14)，青霉屬sp.(AJ13) 5類內生真菌菌株后，苗高、地徑、葉綠素含量、葉綠素熒光參數和值較對照組明顯提高，而隨著低磷脅迫程度的加重，根際和非根際土壤酸性磷酸酶活性明顯提高，表明內生真菌對低磷脅迫下的杉木生長、光合作用及根際和非根際土壤酸性磷酸酶活性有明顯的促進作用，但不同菌株間的促進效果存在差異。此外，艾如波等研究還發(fā)現(xiàn)，分別接種NG1、CG5、AJ6、AJ14、AJ13 5類內生真菌，均能顯著提高低磷脅迫下杉木幼苗的超氧化物歧化酶活性，其中AJ6、AJ14菌株還能有效提高幼苗的可溶性蛋白質含量。表明接種適合的內生真菌可在一定程度上緩解低磷脅迫對杉木植株的傷害，保護植株正常生長，但其相應的分子機制尚不明確。

5 展望

杉木作為我國南方特有的傳統(tǒng)速生用材樹種，林地大部分分布在酸性紅黃壤區(qū)域，土壤有效磷含量欠缺已成為限制杉木生長發(fā)育和產量的關鍵因子，為此杉木營養(yǎng)高效利用育種，尤其是杉木磷素高效利用品系選育研究一直備受關注。已有的研究大多集中在杉木人工林施肥、培育和遺傳育種，以及低磷脅迫下幼苗的根系形態(tài)構型、脅迫生理響應、土壤養(yǎng)分維持等方面。但隨著分子生物學技術的發(fā)展，從分子水平解析杉木的磷酸鹽轉運過程和低磷脅迫響應機制或將會受到越來越多學者的關注。但現(xiàn)有的研究，多是基于模式植物擬南芥，農作物玉米、大豆、水稻等的研究基礎上開展的，而且多數研究只限于初步探索或是對已有相關研究結果的進一步驗證。此外，由于低磷脅迫對非模式植物的影響并非都與模式植物擬南芥相同，如玉米、水稻等作物的主根生長在低磷脅迫下不僅不受抑制，反而有所伸長，表明低磷對植物根系生長的調控網絡非常復雜，整個過程中有轉錄因子、蛋白激酶、細胞擴張蛋白等一系列基因參與調控。基于此，建議今后重點在以下幾個方面開展相關研究，主要包括低磷調控杉木磷轉運子的分子機制、低磷脅迫下杉木根系形態(tài)構型變化的分子機理、杉木根系活化利用非可溶態(tài)磷的分子機制(如杉木根系有機酸合成和分泌的分子機制、杉木分泌酸性磷酸酶參與活化有機磷的分子機制)、杉木—內生真菌共生體的特性及其對低磷脅迫的響應機制等，以期更深入地解析杉木磷素吸收利用的分子機制，篩選和培育出磷素高效吸收利用的杉木優(yōu)良品系，推動杉木營養(yǎng)和遺傳育種研究的持續(xù)發(fā)展。