雞精液稀釋保存與性別控制研究進展

蔣玲艷　張在　王林果

摘 要：雞精液的稀釋與保存方式與受精率密切相關，直接影響著種雞養(yǎng)殖的效益。由于技術限制，目前雞精液保存技術還處于研究階段，生產上仍采取“現采現用”的方式直接采精授精。性別控制在畜禽養(yǎng)殖中具有重要應用價值和經濟意義。由于雞的生殖特點，目前的精子分離技術還不適用于雞，早期胚胎性別鑒定對雞性別控制有重要應用價值。而性別決定和性別控制是一個復雜的過程，與性染色體和環(huán)境均密切相關。因此，本文結合生產上雞性別控制技術的應用現狀，提出通過研究雞精液的稀釋保存技術和改變母雞生殖道受精環(huán)境等方法，開發(fā)出適合種雞養(yǎng)殖的性別控制策略，對于養(yǎng)殖生產應用和解析動物性別決定機制具有重要意義。

關鍵詞：雞精液;稀釋液;保存;性別控制

中圖分類號：S831.2 文獻標識碼：A 文章編號：1673-1085（2022）04-0057-06

畜禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展與現代化，取決于畜禽優(yōu)良種質資源的選育、繁殖和擴養(yǎng)。而人工授精技術的發(fā)展，克服了自然交配的難點和局限性，能有效利用優(yōu)良種質資源的優(yōu)勢，繁殖出性能優(yōu)良的后代，大大提高繁殖效率，有效降低養(yǎng)殖成本、極大地提高經濟效益，加快了畜禽養(yǎng)殖現代化進程。在人工授精的生產過程中，精液的品質及其稀釋保存技術直接決定著生產繁殖效率和后代品質。穩(wěn)定的精液保存技術可以促進優(yōu)質種質資源的傳播，拓寬精液使用的地域范圍，提高精液的利用率。因此，精液的保存技術是人工授精技術發(fā)展應用的先決因素和基礎，是種質資源保存和動物繁殖研究的熱點問題之一。適當稀釋原精并通過一定方法的預處理，有利于提升精液在常溫和低溫條件下的質量，有利于充分利用良種畜禽。性別控制技術的運用，則可讓養(yǎng)殖企業(yè)實現個性化定制養(yǎng)殖，按需養(yǎng)殖，極大降低生產成本，實現畜禽養(yǎng)殖利潤的最大化。有研究指出，雞性別決定基因與環(huán)境互作，決定雞性別。因此，在精液稀釋液中添加與性別決定基因互作的物質，有可能實現雞性別控制。因此，本文綜述了雞精液的稀釋保存技術研究進展、影響雞性別控制的因素及適合用于生產的雞性別控制方法，結合生產上雞性別控制技術的應用現狀，提出通過優(yōu)化雞精液的稀釋保存技術和改變母雞生殖道受精環(huán)境等方法，從精液能量代謝和關鍵基因的表達調控方面來調節(jié)不同精子的代謝與活力，從而開發(fā)出適合種雞養(yǎng)殖的性別控制策略。

1 精液的冷凍保存方法

目前，生產實際應用的精液保存方法主要有冷凍保存（超低溫-79 ℃或-196 ℃液氮保存）、低溫保存法（0～5 ℃）和常溫保存法（15～25 ℃）。冷凍保存法可以使精液活力保存更久，對于畜禽生產發(fā)展和種質資源保護、建立瀕臨滅絕的珍稀動物遺傳資源以及地方特色動物品種資源庫等方面具有重要意義。有關家畜精液冷凍保存技術的研究，時間早且多，在家畜生產中迅速發(fā)展，以目前奶牛精液冷凍保存應用最為廣泛。但冷凍精液在畜禽養(yǎng)殖實際應用方面仍存在多方面的困難：精液的冷凍保存需要選擇合適的冷凍保護劑，需要配備特殊的冷凍保存設備，具有嚴格的冷凍和解凍程序，否則精子容易發(fā)生冷休克;冷凍精液運輸也不方便，且冷凍精子的受精率明顯低于新鮮精子。

禽冷凍精液保存技術研究較晚，精液冷凍技術體系正在探索與完善中[1]。目前，雞新鮮精液的受精率可達90%以上，而雞的冷凍精液的受精率僅為55%左右[2，3]。與豬、牛等動物精子相比，雞精子頭部更細長、尾部更長，在冷凍、解凍的過程中更容易受到損傷、斷裂，導致精子無法直線游動，從而導致受精率低下。為了保持雞精液的品質、突破雞精液保存技術的難題，研究人員結合雞精子特點與精液冷凍原理，從雞精液的冷凍稀釋液、冷凍保護劑種類、冷凍程序、解凍程序、添加抗氧化劑、冷凍劑型等方面不斷進行研究。Najafi等[4]報道用8%甘油作為冷凍保護劑，添加蝦青素做抗氧化劑的精液稀釋液，可以讓羅斯308品種的25周雞精液冷凍保存時間達到30 d，且解凍后精子活率為68.6%，是目前報道冷凍保存雞精液時間最長的報道。

2 精液的液態(tài)保存技術

由于在低溫和常溫條件下保存的精液為液態(tài)，因此精液的低溫和常溫保存方法也稱為液態(tài)保存法。馬玉婷試驗顯示[5]，通過優(yōu)化雞精液稀釋液的組成、滲透壓、pH等因素，滿足精子存活需要的能量，保存稀釋液的滲透壓接近雞精液的滲透壓330～120 m.sm/kg、維持pH在精液生理pH 7.2～7.4，可以使精液在0～5℃低溫下保存5 d，精子活率≥50%。但低溫保存和冷凍保存會對雞精子的超微結構有不同程度的損傷，從而影響精子的活力與受精率。

相對冷凍精液保存而言，精液液態(tài)保存具有整個操作步驟簡單、不需要購買額外的設備、成本低、常溫保存的精液人工授精可獲得較高的受精率、整個操作過程中的影響因素（如稀釋液成分、稀釋倍數、溫度和pH值）可控性強、便于在生產實際中推廣應用等優(yōu)點。常溫保存技術在豬精液的保存方面得到了廣泛的研究。由于家禽為卵生，一年的大部分時間在不斷繁殖、產卵，種母雞在產蛋期間需要定期不斷授精，而公雞精子在母雞生殖系統中存活的時間有限，授精周期短，為了保證必要的種蛋受精率，生產上種母雞一般5 d左右人工授精一次，需要的精液量多且新鮮，且精液采集后一般需要在0.5 h內完成授精工作。因此，大型種雞場的飼養(yǎng)員每天下午都要采精和分批次對種母雞進行授精，工作時間安排很被動?？紤]到種家禽的這種短授精周期、高受精率和多精液量的需求，低溫與常溫保存技術在養(yǎng)雞生產中更被期待、經濟價值更高、實際應用前景更廣泛。

3 影響雞精液保存的因素

影響雞精液保存品質和精子活力的因素很多，包括精液自身品質、稀釋液成分、稀釋倍數、滲透壓、抗氧化劑、保存溫度與時間、pH、光照、保存容器、微生物污染、抗菌藥應用等[1，5]。此外，不同品種、不同日齡的家禽，其精液保存的方法可能也有差異。有報道稱，用同樣的冷凍保存技術保存不同品種的雞精液，最后復蘇精子成功率和受精能力也不同[1]?；钚匝酰≧OS）的累積是目前精液保存過程面臨的問題之一?；钚匝趵鄯e過量時，會使精子膜質系統的脂質發(fā)生過氧化損傷，影響精子的正常功能。由于雞精子質膜的成分特點，與哺乳動物相比，雞精子更易發(fā)生脂質過氧化損傷。因此，在精液常溫保存中添加合適比例的稀釋液，適當添加抗氧化劑及其他保護成分有助于改善精液品質，有效降低活性氧自由基的對精子的影響。施文[6]研究結果顯示，在雞精液稀釋液中添加0.20 μg/mL的蝦青素，常溫保存雞精液2 d，對雞精液中的精子活力與精子頂體、質膜完整率有較好的保護效果;低溫保存3 d后，雞精子的授精率為63%，明顯高于對照組。目前在精液稀釋中添加的抗氧化劑有超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽、維生素C、維生素E、褪黑激素、低分子殼聚糖、白藜蘆醇、蝦青素等[6，7]。

雞的精液量較少，但精子密度高、粘度大，在室溫下容易發(fā)生聚集，影響受精率。合理地對雞精液進行稀釋，可以增加精液體積，降低精子密度，增加授精次數，提高種用公雞利用率。因此，種公雞原精液濃度的計算和合適的稀釋倍數對保持高受精率有重要意義。種雞授精時間和授精間隔等因素也對種蛋的受精率有明顯影響。有關研究報道：種母雞每次輸入0.5億～0.8億個有效精子，可在輸精間隔為5 d時確保種蛋必要的受精率[8]。

精液保存稀釋液的滲透壓和pH緩沖液，不僅給精子提供能量，而且保障精細胞的滲透壓pH值的相對穩(wěn)定，可延長精子的壽命[9，10]。添加磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉等磷酸鹽作為稀釋液中的pH緩沖液，常溫保存雞精液，雞精子存活時間可達72 h，對精子活力和正常形態(tài)有較好的保護[11]。添加果糖或蔗糖作為能量物質保存精液，可減緩精子代謝，在保持精子活力、活率與有效精子數等方面效果較好[12]。因此，綜合考慮雞精液稀釋保存液的營養(yǎng)組分、稀釋倍數、抗氧化劑、滲透壓、pH緩沖劑、能量物質和保存溫度等因素，可以明顯延長雞常溫保存時間，并保證必要的精子活力和正常形態(tài)，從而保證必要的受精率。

4 雞性別控制技術及其應用

性別控制就是依據動物不同性別的解剖和生理結構特點、精子的結構特點，采用一定的技術和方法，將雌性動物和雄性動物在胚胎時期或出生時區(qū)別開來，或者在受精前將決定性別的精子分離開來，從而在生產過程中控制飼養(yǎng)動物的性別比例。由于經濟動物雌雄性在生產力和經濟效益上的差異，性別控制能充分發(fā)揮公、母畜禽的獨特的繁殖性能，加速遺傳育種進程和提高育種效率，優(yōu)化商品動物，獲得優(yōu)質的肉、奶、蛋和毛、皮等動物產品，在畜禽生產中具有重要的經濟和應用價值，還可排除伴性遺傳的有害基因的危害。因此，性別控制是改良品種、提高經濟效益的重要研究方向，成為生產中的一個重要應用研究問題。

雞的性別與其生產效益密切相關。雞蛋及蛋類產品是種雞和蛋雞養(yǎng)殖生產中的主要產品，也是人類食物營養(yǎng)的重要來源。日常生活中，人們更喜歡食用母雞品種的肉。蛋雞生產中，母雞的飼養(yǎng)生產價值遠高于公雞，孵化生產母雞苗具有更大的經濟價值。因此，通過性別鑒定或分選公雞精子或改變精液保存方法來提高母雞的孵化率具有重要的實際生產應用價值。目前，養(yǎng)雞生產主要通過1日齡雛雞的翻肛看生殖器來分離公雞與母雞，然后淘汰不期望的雛雞苗，大量淘汰小雞被屠殺處理，造成巨大經濟損失并牽涉到動物福利問題。如果能夠在雞受精前或胚胎早期實現對雞性別的調控，在生產過程中根據需要獲得單一性別的雞苗，則可以大量降低因雛雞淘汰帶來的養(yǎng)殖成本，減少由此帶來的經濟損失和人力、物質的浪費，為整個養(yǎng)殖行業(yè)帶來巨大的經濟效益。因此，實現對雞性別的控制是目前家禽養(yǎng)殖業(yè)亟需解決的重要問題。

性別控制的物質基礎是性別決定，即決定性別的染色體或基因。性別決定過程主要通過基因和環(huán)境這兩種因素獨立或共同調控。魚類和爬行類動物通常為環(huán)境依賴型性別決定，這些動物體內沒有明確的性染色體，其性別決定受到溫度、光照和激素等外界環(huán)境因素影響。而哺乳動物和鳥類的性別決定由遺傳因素控制，其性別決定過程主要由性染色體控制[13]。目前，哺乳動物和鳥類實現性別控制的途徑主要有精子分離法、胚胎性別鑒定法以及控制授精環(huán)境。目前牛、豬等哺乳動物的性別控制法主要采用精子分離法，即主要采用流式細胞儀將X、Y精子分離。雞的性別主要由Z染色體和W染色體決定，母雞是異型配子性別（ZW），而公雞是同型配子性別（ZZ）。雞的生殖特點和人工授精技術應用，決定了整個種蛋的生產過程中需要頻繁采精、授精，給雞精液的保存方法和精子的分選方法和儀器的便捷實用性增加了難度。因此，目前未查閱到有關于家禽精子分離的相關報道。

4.1 雞胚胎性別鑒定

在胚胎期間，依據性染色體的基因或染色特性差異、性激素差異，對動物胚胎的性別進行鑒定，選擇或淘汰某一性別的胚胎，也是一種控制后代性別的方法。雞胚胎性別鑒定方法有總DNA序列鑒定法、激素鑒定法和分子標記鑒定法?？蒲腥藛T利用光譜學原理，通過對孵化3 d后的雞胚DNA含量測定，根據雄性胚胎DNA含量比雌性雞胚高2%進行性別鑒定，準確率達95%[14]。德國有科學家開發(fā)出生物標識物和化學標記，能分別通過質譜分析法和化學檢測進行雞胚性別鑒定，且最早可在卵子受精9日后鑒定出雞胚雌雄。雞W染色體上Hintw基因是雞性別決定過程中的關鍵基因，該基因在不同性別雞的性細胞、早期胚胎和性腺發(fā)育過程以及雛雞不同組織中的表達水平存在截然不同的表達規(guī)律，在雞雌性胚胎及組織中的表達明顯高于雄性[15]。雄性雞和雌性雞在早期囊胚和雞胚成纖維細胞中表現出基因表達差異，從而出現能量代謝差異和表觀遺傳差異，表現在：雄性雞囊胚中糖酵解高于雌性，蛋白乙?；杆矫黠@高于雌性，DNA甲基化水平顯著低于雌性[15]。因此，根據雞胚胎中的性別決定相關基因表達水平或雞早期囊胚中的能量代謝水平，或不同性別胚胎激素水平，可研究出鑒別雞早期胚胎性別的方法。

雞胚胎性別鑒定在實際應用中還面臨一個關鍵問題：就是需要穿過蛋殼取樣測定，這會不同程度的損壞蛋殼的完整性，還可能造成污染，且樣品量大。因此，就目前的技術來看，從胚胎階段來鑒別雞只的性別，不如從1日齡雞苗鑒定性別簡單易操作。然而，毫無疑問的是：雞胚性別鑒定越早，種雞養(yǎng)殖生產的經濟損失就越低，淘汰雞胚的利用價值越高，就可避免淘汰活生生的小雞。

4.2 改變受精環(huán)境

哺乳類和鳥類的生殖系統有明確的分工，雄性動物產生不同類型的精子，支配著性別的決定權，而雌性動物體內環(huán)境具有支配性別的選擇權，因而改變雌性動物受精的環(huán)境（如子宮、陰道等處的環(huán)境）有可能改變性別比例。有學者利用5%精氨酸預處理日本河牛的子宮頸，然后輸精，使母犢?？刂坡蔬_到80%。由于雞的生殖特點，需要特殊儀器的精子分離方法對于雞的性別控制很難在生產中實施，能否通過改變精液稀釋液的組成，改變雞精液受精的環(huán)境，或改變精子形成的內在環(huán)境，從而進行性別控制呢？有報道[16]指出，如將芳香化酶抑制劑于輸精前經泄殖腔向母禽輸卵管灌注，或用芳香化酶抑制劑稀釋公禽新鮮精液，進行雞性別控制。

孫長花[15]研究發(fā)現，Hintw基因是雞胚性別決定過程中調控網絡的核心，Hintw基因通過與雌性性別相關基因Ube2i發(fā)生互作參與雞胚早期的性別決定過程;雌性的細胞中HINTW（Hintw基因表達產物）能夠與UBE2I（Ube2i基因表達產物）結合，而HINTZ無法與UBE2I結合。這些結果是否暗示了：通過優(yōu)化雞精液的保存方法和改變母雞體內受精環(huán)境，從精液能量代謝和關鍵基因的表達調控方面來調節(jié)不同精子的代謝與活力，從而實現雞的性別控制。在雞生殖道內或在雞精液稀釋液中添加性別相關基因的表達產物，則可能改變雞胚的性別比例。此外，也有報道[13]稱給種母雞飼喂葡萄糖，也可以明顯改變其后代的性別比例。

5 展望

人工授精技術推動養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；F代化發(fā)展，而精液的品質和保存方式決定著養(yǎng)殖產品的質量和生產成本，性別控制則可實現“按需養(yǎng)殖”，充分體現不同性別動物的最大養(yǎng)殖價值。而性別決定和性別控制是一個復雜的過程，與性染色體和環(huán)境均密切相關，充分了解性別決定的過程，才能更好的利用相關理論進行性別控制。家禽有不同于家畜的特殊生殖過程，禽胚在發(fā)育過程中的性別易受胚液成分的影響，且可發(fā)生性別反轉。根據家禽生殖的特點，結合相關研究結果，從雞精液保存、受精環(huán)境和性別決定過程等方面，研究基因與環(huán)境的互作的關系，開發(fā)雞性別控制的方法，對于養(yǎng)殖生產應用和解析動物性別決定機制具有重要意義。

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The Research Progress of Chicken Semen Dilution Preservation and Chicken Sex Control

JIANG Lingyan ZHANG Zai WANG Linguo

（1. Guangxi Agricultural Vocational and Technical University Guangxi，Nanning 530000，China;

2. Pulike Bio-engineering Co.， Ltd，Henan Luoyang? 471000，China）

Abstract： The dilution and preservation methods of chicken semen are closely related to the fertilization rate and directly affect the benefit of breeding chicken. Due to technical limitations， the preservation technology of chicken semen is still in the research stage， and the method of "collecting and insemination" is still adopted in production. Sex control has important application value and economic significance in livestock and poultry breeding. Due to the reproductive characteristics of chickens， the current sperm separation technology is not suitable for chickens， and the early embryo sex identification is of great application value for chicken sex control. Sex determination and sex control is a complex process which is closely related to sex chromosomes and environment. Therefore， in combination with the current situation of the application of chicken sex control technology in production， this paper proposes to develop a suitable breeding chicken sex control strategy by studying the dilution preservation technology of chicken semen and changing the fertilization environment of hen reproductive tract， which is of great significance for breeding production application and analysis of the mechanism of animal sex determination.

Keywords：Chicken semen; Dilution; Preservation; Sex control