生物內(nèi)源性SO2的熒光檢測

溫雨欣，巢暉

中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院，生物無機(jī)與合成化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006

1 引言

一氧化氮分子(NO)曾是一個普通的無機(jī)分子，一度被認(rèn)為是廢氣和空氣污染物，人們很難將它與生物體內(nèi)的健康調(diào)控聯(lián)系起來。然而，1998年三位美國科學(xué)家因發(fā)現(xiàn)“NO在心血管系統(tǒng)中起信號分子作用”而共同獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎，自此以后，以NO為代表的無機(jī)小分子氣體作為氣體信號分子在生物體內(nèi)的作用引起了科學(xué)家們的關(guān)注并前赴后繼。早些年科學(xué)家氣體信號分子的研究主要集中在NO、CO和H2S，如Lippard課題組[1]開發(fā)了一組基于金屬復(fù)合物(Co(II)、Fe(II)、Ru(II)、Rh(III)和Cu(II)復(fù)合物)開啟熒光的NO傳感器；林偉英課題組[2]基于硝基還原反應(yīng)開發(fā)了一種新的CO熒光探針用于檢測活細(xì)胞溶酶體中的CO，唐波課題組[3]構(gòu)建了一種基于氰的近紅外比率型熒光探針以進(jìn)行快速且高靈敏度地檢測內(nèi)源性H2S等，這些研究的發(fā)現(xiàn)又在一定程度上促進(jìn)了化學(xué)家們對活體內(nèi)氣體信號分子的探索。

但是，盡管化學(xué)家對上述幾種氣體信號分子有較為全面且深入的研究，卻對內(nèi)源性SO2的研究和示蹤鮮有報(bào)道，使得SO2只能以空氣污染物和酸雨的成因長期存在于人們的視野，誤以為其只能外源性產(chǎn)生和攝取而忽略了其在生物體內(nèi)的作用。然而，近年來，隨著生物體內(nèi)檢測技術(shù)的提高和檢測范圍的擴(kuò)大，人們逐漸注意到SO2不僅能在生物體內(nèi)內(nèi)源性生成，而且作為氣體信號分子在生物體中起到調(diào)控作用，調(diào)節(jié)某些mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)并影響生理系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。本文就SO2在生物體內(nèi)的內(nèi)源性生成、生理作用和熒光檢測三大方面進(jìn)行闡述，旨在向讀者揭示SO2鮮有人知的一面，即作為信號分子如何在生物體內(nèi)發(fā)揮作用，并綜述了近年來化學(xué)家們對內(nèi)源性SO2進(jìn)行檢測和復(fù)雜的代謝循環(huán)示蹤的探索過程。

2 生物體內(nèi)SO2的來源與作用

作為氣體信號傳送器，SO2在生物體內(nèi)的調(diào)節(jié)作用不容小覷，在維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。與多數(shù)內(nèi)源性活性物質(zhì)相似，內(nèi)源性SO2在不同的生理濃度下發(fā)揮著不同的作用，可分為低濃度的生理調(diào)節(jié)作用和高濃度的毒理作用：在低濃度的時(shí)候，SO2可以起到抗氧化、減少炎癥以及抗抑郁和抗焦慮的作用，特別是在血管調(diào)節(jié)方面，SO2與抗高血壓、抗動脈粥樣硬化和抑制血管硬化的調(diào)節(jié)作用密不可分[1]；但在高濃度的時(shí)候，SO2會引起某些呼吸道疾病、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂甚至是癌癥[6]。因此，高效檢測生物體內(nèi)的SO2顯得尤為重要。

3 生物體內(nèi)SO2的檢測

3.1 SO2的熒光檢測原理

這些探針在生物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)對SO2特異性檢測最重要的是要有合適的反應(yīng)位點(diǎn)，而SO2與反應(yīng)位點(diǎn)的特異性結(jié)合恰恰是基于我們耳熟能詳?shù)囊恍┗A(chǔ)反應(yīng)，特別是親核加成反應(yīng)，主要可以分為SO2催化乙酰丙酸酯水解、SO2與醛基的加成反應(yīng)和Michael加成反應(yīng)三種(圖1)。

圖1 三種親核加成反應(yīng)的檢測原理

(1)SO2催化乙酰丙酸酯水解。

化學(xué)家常用乙酰丙酸酯來保護(hù)官能團(tuán)，而熒光可以通過保護(hù)羥基而淬滅[8]，故利用乙酰丙酸酯可被SO2催化而水解的性質(zhì)可以起到“光開關(guān)”的作用，使熒光信號發(fā)生變化，實(shí)現(xiàn)對SO2的存在性檢測。華中師范大學(xué)馮國強(qiáng)課題組[9]基于乙酰丙酸酯脫保護(hù)的機(jī)理開發(fā)了一種用于亞硫酸鹽陰離子的近紅外(NIR)熒光探針(probe 1)，該探針使用萘的硫化物作為NIR熒光素和兩個乙酰丙酸基團(tuán)的反應(yīng)點(diǎn)，并對二甲基亞砜-磷酸(DMSO-PBS)緩沖液中亞硫酸鹽陰離子開啟熒光信號變化以及做出快速且高選擇性的反應(yīng)。

(2)SO2與醛基的加成反應(yīng)。

山西大學(xué)張永斌課題組[10]基于在弱酸性條件下亞硫酸氫鹽與醛基的特定親核加成反應(yīng)可以形成氫鍵設(shè)計(jì)了一種能在生物體內(nèi)快速有效識別SO2的熒光探針(NA-CHO)。由于氫鍵的存在，醛連接的肼與SO2結(jié)合形成一個五元環(huán)，而其他硫醇因空間位阻而不能形成五元環(huán)，故該探針可以在生物體內(nèi)特異性檢測SO2而不受其他硫活性物質(zhì)的干擾。

(3)Michael加成反應(yīng)。

山西大學(xué)陰彩霞課題組[11]通過Michael加成反應(yīng)成功構(gòu)建了雙位點(diǎn)功能化NIR熒光探針(NIRSP)，該探針能夠用于檢測生物體內(nèi)SO2濃度的高低，表現(xiàn)出具有紅色熒光響應(yīng)的低濃度SO2和具有藍(lán)色熒光增強(qiáng)功能的高濃度SO2，具體來說，該探針能夠辨別SO2濃度的高低是基于NIR-SP中不飽和C＝C雙鍵(位點(diǎn)1)反應(yīng)性優(yōu)于醛基(位點(diǎn)2)而實(shí)現(xiàn)的，由此我們可以通過SO2結(jié)合不同反應(yīng)位點(diǎn)所產(chǎn)生的熒光信號的不同來判別其濃度的高低。

3.2 外源性SO2的熒光檢測

圖2 熒光探針1的檢測原理[13]

3.3 內(nèi)源性SO2的熒光檢測

圖3 熒光探針SP-2與的反應(yīng)原理[14]

圖4 在不同掃描深度(80–160 μm)大鼠腦部海馬體切片內(nèi)亞硫酸鹽的熒光成像[16]

這些實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果在一定程度上為SO2作為生物體內(nèi)信號分子的觀點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)支撐，同時(shí)也為檢測內(nèi)源性SO2并進(jìn)行代謝示蹤奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

3.4 SO2熒光探針的分類

當(dāng)前，隨著時(shí)代的發(fā)展，各種材料的結(jié)合逐漸凸顯出其性能上與眾不同的優(yōu)越性，檢測SO2的熒光探針的發(fā)展也不僅僅局限于單一的結(jié)構(gòu)和材料，故按材料我們大致可以將其分為金屬配合物熒光探針、有機(jī)小分子熒光探針和納米材料熒光探針三類。

(1)金屬配合物熒光探針。

圖5 金屬配合物熒光探針I(yè)r4[20]

(2)有機(jī)小分子熒光探針。

有機(jī)小分子熒光探針是最常見的檢測生物體內(nèi)氣體信號分子的一種探針，通過熒光基團(tuán)和能與目標(biāo)分子發(fā)生特異性反應(yīng)的有機(jī)小分子基團(tuán)雜交，調(diào)節(jié)其在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性從而具有生物成像能力。中南大學(xué)宋相智課題組[19]將帶正電的苯并吡喃和香豆素結(jié)合，開發(fā)了一種具有優(yōu)異水溶性和高選擇性的近紅外熒光探針(Probe 2)(圖6)，該熒光探針可在生物系統(tǒng)中定量和特異性檢測SO2。

圖6 有機(jī)小分子熒光探針Probe 2

(3)納米材料熒光探針。

石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)是一種性能優(yōu)越的納米碳材料，例如高量子產(chǎn)量、良好的水溶性和生物相容性[21]，且因?yàn)镚QDs和有機(jī)分子探針之間的π-π相互作用，它們之間可能會存在FRET效應(yīng)[22]，這些均為應(yīng)用于生物成像提供了可能性。基于這一點(diǎn)，濟(jì)南大學(xué)林偉英課題組[23]開發(fā)了一種獨(dú)特的多比例復(fù)合熒光探針(CP@GQDs-OH)(圖7)，該新型納米材料熒光探針對SO2具有三種線性比例變化的高選擇性，成功應(yīng)用于檢測活細(xì)胞和斑馬魚中的SO2，為多比例熒光探針的開發(fā)開辟了新的道路。

圖7 多比例復(fù)合熒光探針CP@GQDs-OH

4 生物體內(nèi)SO2代謝的熒光示蹤

新陳代謝是一個生物體健康運(yùn)作所必需的生命過程，監(jiān)測生物體內(nèi)各物質(zhì)代謝的復(fù)雜過程已成為化學(xué)家和生物學(xué)家所關(guān)注和面臨的重要問題。隨著對SO2的親核加成反應(yīng)的不斷深入以及聯(lián)合各種協(xié)同機(jī)制，化學(xué)家們不愿僅僅停留在檢測生物體內(nèi)源性SO2的有無以及含量上，更多的是開始考量SO2在復(fù)雜體系所充當(dāng)?shù)慕巧约八伎既绾螌O2在體內(nèi)的代謝進(jìn)行示蹤，以期許更全方位地了解SO2與生物健康的關(guān)系。

山西大學(xué)陰彩霞課題組[24]通過ICT-FRET協(xié)同機(jī)制合理設(shè)計(jì)并利用了一種新的多信號熒光探針(Mito-CM-BP)同時(shí)檢測谷胱甘肽(GSH)及其代謝物SO2，該探針實(shí)現(xiàn)了在兩個獨(dú)立通道中可視化從GSH到SO2的新陳代謝過程并且無光譜交叉干擾(圖8)。具體來說，基于通過哺乳動物體內(nèi)的硫磺轉(zhuǎn)移酶(硫轉(zhuǎn)移酶)，Na2S2O3可以結(jié)合GSH從而產(chǎn)生內(nèi)源性二氧化硫衍生物[25]，亞硫酸鹽氧化酶(SUOX)的存在可以將亞硫酸鹽氧化成硫酸鹽[26]的背景，通過與探針預(yù)處理的細(xì)胞與Na2S2O3孵化一段時(shí)間后GSH的消耗過程來評估Mito-CM-BP監(jiān)測GSH代謝的能力；然后以RNA干擾降低了細(xì)胞中的SUOX水平為理論基礎(chǔ)，通過敲除siRNA-SUOX后細(xì)胞表現(xiàn)的熒光變化來說明siRNA對SUOX活性的抑制將會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)SO2水平的增加，從而表明了該探針能用于實(shí)時(shí)示蹤活細(xì)胞中SO2的新陳代謝過程；最后通過在腫瘤模型中檢測SO2代謝過程的能力，進(jìn)一步說明了該探針可以作為可視化生物體內(nèi)SO2代謝過程的有力工具。

圖8 Mito-CM-BP的設(shè)計(jì)和檢測原理[24]

更重要的是，該探針已成功應(yīng)用于活細(xì)胞和小鼠模型中，對其進(jìn)行SO2的實(shí)時(shí)監(jiān)測，闡明了GSH與TST(硫代硫酸轉(zhuǎn)移酶)之間的酶反應(yīng)可以代謝SO2和實(shí)現(xiàn)了對SO2在SUOX下可以轉(zhuǎn)化為硫酸鹽過程的可視化，推動了SO2產(chǎn)生的途徑的闡明并有助于發(fā)現(xiàn)SO2及其衍生物在生命系統(tǒng)中的新作用。

5 結(jié)語

通過上述研究結(jié)果展示，熒光檢測可以幫助我們在生物體內(nèi)對內(nèi)源性SO2進(jìn)行存在性檢測和代謝示蹤，更深入地了解SO2與GSH等活性物質(zhì)在生物系統(tǒng)中相互關(guān)聯(lián)的生理功能，為洞悉SO2等氣體信號分子與生命健康之間的內(nèi)在聯(lián)系提供有力的技術(shù)支撐。