多指標(biāo)-響應(yīng)曲面法優(yōu)選連翹中抗痤瘡有效部位的提取工藝研究

李思思，遆安航，譚麗媛，翟康欣，張淑蓉

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619）

連翹為木樨科植物連翹［Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl］的干燥果實(shí)，傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為連翹具有消腫、清熱、散結(jié)等作用，素有“瘡家圣藥”之稱。“連翹主治一切炎性疾患，如癰疽、瘰疬、乳癰、丹毒、風(fēng)熱感冒、溫病初起、溫?zé)崛霠I、高熱煩渴、神昏發(fā)斑、熱淋澀痛等［1］”?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、解熱等藥理作用［2-3］，得益于連翹中含有的苯乙醇苷類、木脂素類、萜類、黃酮類等多種類型的化合物。痤瘡好發(fā)于青少年，丙酸桿菌是痤瘡發(fā)生的致病菌之一，抗菌治療是抗痤瘡的必要手段。氧化應(yīng)激是由于細(xì)胞中產(chǎn)生了過多的活性物質(zhì)，如活性氧簇和活性氮簇，超過抗氧化物的清除能力，導(dǎo)致了大分子生物（糖、脂質(zhì)及與蛋白質(zhì)）的氧化，氧化應(yīng)激反應(yīng)是引發(fā)痤瘡的重要因素，所以抗氧化也是治療痤瘡的有效措施［4］。本試驗(yàn)選擇兼具抗菌、抗氧化的連翹酯苷B、連翹酯苷A、蘆丁為參考指標(biāo)，以HPLC法為檢測手段，考察不同溶劑、不同提取時(shí)間、提取次數(shù)、溶劑加入量對連翹抗痤瘡有效部位提取工藝的影響，使用Box-Behnken響應(yīng)曲面法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最佳提取工藝，為后續(xù)制備連翹抗痤瘡洗護(hù)用品提供參考和依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters e2695型高效液相色譜儀；MF204十萬分之一天平（瑞士梅特勒托利多公司）；FA224千分之一電子天平（上海舜宇科學(xué)儀器有限公司）；HDM-500數(shù)顯電熱套（金壇杰瑞爾電器）。連翹藥材采自山西太原汾河公園（蒸制30 min后在60℃以下烘干），經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)裴香萍教授鑒定為《中國藥典》收錄品種；連翹酯苷B對照品（批號111810-201907）、連翹酯苷A對照品（批號161079-160828）、蘆丁對照品（批號161153-160831）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲酸（色譜純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；無水乙醇（分析純，天津市北辰方正試劑廠）；甲醇（色譜純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；娃哈哈純凈水（娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜條件

色譜柱BDSHYPERSIL C18（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫，程序見表1。HPLC流速1.0 mL/min，柱溫為25℃，檢測波長為270 nm，進(jìn)樣體積為10μL。

表1 梯度洗脫條件

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取連翹酯苷B、蘆丁和連翹酯苷A對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含連翹酯苷B對照品0.227 mg/mL、連翹酯苷A對照品0.766 mg/mL和蘆丁對照品0.318 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 使用萬分之一天平量取連翹20 g，并置于圓底燒瓶中，精密加入60%乙醇溶液280 mL并稱定重量，加熱回流2.5 h，使用3層紗布濾過，按以上步驟重復(fù)操作3次，合并濾液，確定濾液體積，使用移液管將濾液精密量取1 mL置10 mL量瓶中，使用60%乙醇進(jìn)行定容，搖勻，濾過，將續(xù)濾液用0.45μm微孔濾器過濾，得到供試品溶液。

2.3 測定法

精密吸取2.2.1項(xiàng)下對照品溶液、2.2.2項(xiàng)下供試品溶液各10μL，使用2.1項(xiàng)下色譜條件對其進(jìn)行測定，結(jié)果見圖1、圖2。由圖可知，各成分峰形對稱，分離度良好。

圖1 混合對照品溶液HPLC圖

圖2 連翹HPLC圖

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密稱取連翹酯苷B、連翹酯苷A和蘆丁對照品8.04 mg、3.57 mg、4.22 mg，置于10 mL的容量瓶中，加入甲醇使其溶解，稀釋至刻度并且搖勻，作為混合對照品母液。分別精密量取1mL、2mL、3 mL、4 mL、5 mL置于不同的10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得不同濃度的對照液，按上述色譜條件測定峰面積。以各有效峰的面積（Y）為縱坐標(biāo)，對照品的濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)，得連翹酯苷B線性方程為：Y=5565X+213 887（r=0.9998）、連翹酯苷A線性方程為：Y=5984.6X+50 282（r=0.9998）、蘆?。篩=16 086X+41 933（r=0.9999），分別在0.1054～0.817 mg/mL、0.332～1.665 mg/mL、0.0836～0.453 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，對各峰面積進(jìn)行測定，計(jì)算得連翹酯苷B、連翹酯苷A和蘆丁的RSD值分別為0.56%、0.95%、0.73%，均小于3%。表明該儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次連翹藥材6份，按供試品制備項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件對其進(jìn)行含量測定。結(jié)果表明連翹酯苷B、連翹酯苷A和蘆丁的RSD值分別為2.74%、2.35%、2.83%。說明該方法有良好的重復(fù)性。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下同一供試品溶液10μL，于0 h、2 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h分別進(jìn)樣，按上述色譜條件測定，結(jié)果顯示連翹酯苷B、連翹酯苷A和蘆丁含量的RSD值分別為0.1%，0.01%，0.04%。結(jié)果顯示供試品溶液在30 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

精密量取2.2.2項(xiàng)下已知濃度的連翹提取液0.5 mL各6份，分別加入一定量的對照品溶液，按含量測定項(xiàng)下的方法進(jìn)行操作，測定連翹藥材中各成分的平均回收率和RSD值。試驗(yàn)結(jié)果顯示連翹提取液中連翹酯苷B、連翹酯苷A和蘆丁的平均回收率分別是99.6%、100.8%、99.7%，RSD值分別是0.77%、1.08%、0.61%。說明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。

2.9 單因素考察

以連翹酯苷B、連翹酯苷A、蘆丁含量的綜合評分值［1］（Y）為評價(jià)指標(biāo)［Y=（連翹酯苷B含量/連翹酯苷B含量max）×30%+（連翹酯苷A含量/連翹酯苷A含量max）×40%+（蘆丁含量/蘆丁含量max）×30%］，對提取溶媒（水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、100%乙醇）、不同煎煮時(shí)間（0.5、1、2、2.5、3 h）、提取溶媒加入量（6、8、10、12、14、16倍量）進(jìn)行考察，考察結(jié)果見圖3～5。

圖3 不同提取溶媒考察結(jié)果

圖4 溶劑加入量考察結(jié)果

圖5 提取時(shí)間考察結(jié)果

根據(jù)單因素考察結(jié)果，在進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)曲面分析時(shí)，提取溶媒選擇60%乙醇，提取時(shí)間選擇1.5 h、2 h、2.5 h；在溶劑加入量選擇中，由于單因素考察中14倍量至16倍量Y值變化不大，綜合考慮成本問題，選用10倍、12倍、14倍溶劑加入量作為考察指標(biāo)；提取次數(shù)一般不超過3次，所以選用1次、2次、3次為考察指標(biāo)。

2.10 Box-Behnken響應(yīng)曲面法

以煎煮次數(shù)（A）、溶劑加入量（B）和提取時(shí)間（C）為影響因素進(jìn)行考察，以連翹酯苷B、連翹酯苷A和蘆丁綜合評分值（Y）為評價(jià)對象，設(shè)計(jì)3因素3水平共17組試驗(yàn)。因素水平表見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，方差分析見表4。由表4可知，因素A有極其顯著的影響（P＜0.01），因素B與A2均具有較顯著的影響（0.01＜P＜0.05）。回歸方程 為Y=86.31+11.77A+3.99B+2.30C+1.79AB-1.06AC+0.6675BC-4.91A2-2.39B2+3.13C2。相關(guān)系數(shù)r=0.9656，擬合情況良好。調(diào)整相關(guān)系數(shù)r=0.9195，可以解釋91.95%響應(yīng)值的變化，可以用于預(yù)測分析［5-7］。

表2 因素水平表

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

通過Design Expert軟件對表4數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果見圖6。其中圖a（固定煎煮時(shí)間不變）顯示，煎煮次數(shù)不變時(shí)，隨著料液比增大響應(yīng)值一直趨于平穩(wěn)；料液比不變時(shí)，隨著煎煮次數(shù)增加，響應(yīng)值先升高后趨于平穩(wěn)（煎煮2～3次時(shí)響應(yīng)值最高）。圖b（固定料液比不變）顯示，煎煮次數(shù)不變時(shí)，隨著煎煮時(shí)間增長，響應(yīng)值趨于平穩(wěn)；煎煮時(shí)間不變時(shí)，隨著煎煮次數(shù)增多，響應(yīng)值先上升后趨于平穩(wěn)（煎煮時(shí)間為2～2.5 h，煎煮3次時(shí)響應(yīng)值最高）。圖c（固定煎煮次數(shù)不變）顯示，料液比不變時(shí)，隨著煎煮時(shí)間延長，響應(yīng)值趨于平穩(wěn)；煎煮時(shí)間不變時(shí)，響應(yīng)值緩慢升高（料液比為1∶14時(shí)，響應(yīng)值最高，而煎煮時(shí)間影響不大）。綜上所述，直觀得出結(jié)論煎煮時(shí)間為2.5 h，煎煮3次，料液比為1∶14時(shí)為最優(yōu)工藝。軟件所得最佳提取工藝與直觀一致［2］。

表4 方差分析

圖6 響應(yīng)曲面圖

2.11 驗(yàn)證試驗(yàn)

對Design-Expert軟件所得的優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)（n=3），結(jié)果見表5。最終確定提取工藝為用60%乙醇提取，提取3次，每次2.5 h，料液比為1∶14。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

痤瘡在青少年中發(fā)病率極高，且容易復(fù)發(fā)，不僅對患者的外貌造成影響，還會嚴(yán)重影響到青少年的心理健康和生活質(zhì)量。連翹被稱之為“瘡家圣藥”，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其具有確切的抗菌作用［8］。本課題組前期試驗(yàn)采用薄層自顯影技術(shù)對連翹中的熊果酸、連翹酯苷A、齊墩果酸、蘆丁、連翹苷進(jìn)行抗氧化活性成分篩選［3］，見圖7。結(jié)果發(fā)現(xiàn)連翹酯苷A、蘆丁具有明顯的抗氧化作用。在連翹藥材薄層自顯影中，與連翹酯苷A對照相應(yīng)的位置，顯色斑點(diǎn)較大，結(jié)合HPLC色譜圖，分析其可能為連翹酯苷A與連翹酯苷B未分離開的共同斑點(diǎn)；且通過連翹酯苷B對照品與顯色試劑反應(yīng)，證實(shí)連翹酯苷B也具有抗氧化作用。故實(shí)驗(yàn)選用兼具抗菌、抗氧化的連翹酯苷A、連翹酯苷B、蘆丁等3種成分為考察指標(biāo)進(jìn)行抗痤瘡有效部位的篩選。

圖7 連翹抗氧化活性成分篩選

實(shí)驗(yàn)采用多指標(biāo)-響應(yīng)曲面法確定的連翹中抗痤瘡有效部位的提取條件為：提取溶媒60%乙醇，提取3次，每次2.5 h，溶媒加入量為14倍量。提取工藝簡便、易于操作，且專屬性強(qiáng)，可為后續(xù)開發(fā)連翹抗痤瘡洗護(hù)用品提供技術(shù)依據(jù)。