金刺梨果渣發(fā)酵蛋白飼料研究

孔令磊 汪凱莎 唐婷婷

(安順學(xué)院農(nóng)學(xué)院，貴州 安順561000)

金刺梨(RosaSterilisS.D.shi)還被稱為“無籽刺梨”，1981年全省刺梨資源調(diào)查時首次發(fā)現(xiàn)，時圣德先生1985年發(fā)表于貴州省植物園[1]。金刺梨具有少刺無籽、酸甜可口、口感較脆的特點。金刺梨果實中含多種氨基酸、礦物質(zhì)營養(yǎng)元素和維生素，并且營養(yǎng)元素含量非常豐富。其中VC 和黃酮的含量比一般的水果都要高，因此還被譽為“VC之王”。VC的含量中高達14.83mg/g[2]。 如今，金刺梨栽培技術(shù)日益成熟[3-7]，在貴州安順得到大面積種植及推廣，對金刺梨研究也越來越多，多家研究機構(gòu)，單位和個人對金刺梨的營養(yǎng)成分進行分析[8-10]，果實除鮮食外，還可加工成金刺梨酒、金刺梨飲料、金刺梨酥、食醋和果醬等[11-12]，金刺梨中所含單寧[13]在多種醫(yī)療保健中得到應(yīng)用，由于金刺梨很高的利用和營養(yǎng)價值，被人們稱為“新山珍”[14]。

發(fā)酵飼料，是利用各類糟渣、食品加工后留下的副產(chǎn)物、雜粕等原料通過微生物的分解和轉(zhuǎn)化等，產(chǎn)生更利于畜禽采食和利用的飼料。通過發(fā)酵后提高其飼用價值，并在一定程度上豐富氨基酸、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)[15]。近幾年來，發(fā)酵飼料作為一種新型無抗飼料得到廣泛的研究和發(fā)展[16]。其優(yōu)勢原料簡單易得，來源廣泛，經(jīng)過發(fā)酵后的飼料具有獨特的香味，不僅能提高動物的采食率以及消化利用率，還能增強動物機體免疫力[17]。

本研究使用金刺梨果渣(由天賜貴寶公司提供)，經(jīng)過烘干處理，并使用選定的菌種培養(yǎng)獲取生長曲線后種對其進行發(fā)酵。測量金刺梨果渣在發(fā)酵前后的營養(yǎng)成分差異，以蛋白質(zhì)為參照研究金刺梨果渣在發(fā)酵后是否可作為一種理想的蛋白飼料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金刺梨果渣(由天賜貴寶公司提供)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis、網(wǎng)上購買)、酵母膏(生物試劑)、蛋白胨(生物試劑)、瓊脂粉(生物試劑)、葡萄糖(分析純)、無水乙醇(分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

折光儀、紫外可見光光度計(UV-5200PC、上海元析儀器有限公司)、高壓滅菌鍋(LDZX-50KB、上海申安醫(yī)療器械廠)、超凈工作臺(CJ-2D、天津泰斯特儀器有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9050B、上?，樮帉嶒炘O(shè)備有限公司)、振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-F100、江蘇省太倉市華美生化儀器廠制造)、燒杯、玻璃棒、玻璃漏斗、培養(yǎng)皿、量筒、酒精燈、移液槍、接種環(huán)。

1.3 實驗方法

金刺梨果渣發(fā)酵工藝路線：金刺梨果渣→發(fā)酵前營養(yǎng)成分的測定(氨基酸、蛋白質(zhì)、總糖、維生素C)→發(fā)酵菌種的選取、分離、純化、鑒定→獲取發(fā)酵菌種的生長曲線→金刺梨果渣固態(tài)發(fā)酵(不同的無機氮源、菌種接種量、料液比進行單因素實驗)→干燥→粉碎→發(fā)酵后營養(yǎng)成分的測定→果渣發(fā)酵前后營養(yǎng)成分的對比分析。

1.3.1 金刺梨果渣蛋白質(zhì)含量的測定

蛋白質(zhì)的測定通過考馬斯亮藍G-250法[18]，繪制標準曲線見圖1:

圖1 蛋白質(zhì)標準曲線

通過標準曲線查找到金刺梨果渣樣品中的蛋白質(zhì)的含量(平均值)，通過公式(1)計算出樣品中總氨基酸的含量：

公式(1)：蛋白質(zhì)的含量(mg/g)=(M×V×100) / (m×v×1000)

式中：V:樣品提取液的總體積 mL；M：標準曲線上查找所得的蛋白質(zhì)含量ug ；m：所稱取樣品的重量g；v：測定時量取的樣品體積 mL。

1.3.2 金刺梨果渣總氨基酸含量的測定

氨基酸的測定使用茚三酮顯色法[19]，繪制標準曲線見圖2:

圖2 氨基酸標準曲線

在標準曲線上查找出氨基酸的含量(平均值),通過公式(2)計算出樣品中總氨基酸的含量:

公式(2)：樣品中氨基酸的含量(mg/100g)=(M×V×100)/(v×m×1000)

式中：M：標準曲線上查找所得的氨基酸含量ug；V：金刺梨果渣提取液的總體積 mL； v：測定時量取的金刺梨果渣液的體積 mL； m:實際所用金刺梨果渣的重量g。

1.3.3 金刺梨果渣總糖含量的測定

利用折光儀，將果渣碾碎有果汁流出，取適量果汁于折光儀棱鏡玻璃面上進行觀測，明顯分界線刻度，即為金刺梨果渣的總糖的濃度。

1.3.4 金刺梨果渣維生素C含量的測定

果渣維生素C含量的測定使用2，6-二氯酚靛酚滴定法[20]，通過公式(2)計算出樣品中維生素C的含量：

公式(3)：維生素C的含量(mg/100g)=[(V-V1)×V2×K](V3×M)

式中：V：樣品滴定時消耗滴定液的體積 mL，VM1：空白對照消耗值 mL，V2：樣品提取液體積 mL，K：染料標定值 mL，V3：測量的樣品液 mL，M：果渣質(zhì)量g。

滴定過程中空白對照的平均值1.9 mL。染料標定的平均值9.6 mL。

1.3.5 菌種的活化培養(yǎng)

菌種選取經(jīng)過產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces Fragilis)、啤酒酵母(Sac-charomyces cerevisiae)、白地霉(Geotrihum candidum Link)四種菌種進行對比，選取合適的菌種來進行刺梨果渣的發(fā)酵。

經(jīng)各項指標對比后選用產(chǎn)朊假絲酵母：產(chǎn)朊假絲酵母蛋白質(zhì)的含量占菌體干物質(zhì)的2/3，產(chǎn)朊假絲酵母細胞中維生素B和RNA以及礦物質(zhì)[21]含量極其豐富,而且產(chǎn)朊假絲酵母中酶的含量很多，這些酶類在發(fā)酵中至關(guān)重要的作用，這些酶類能將淀粉和纖維素進行水解，是將發(fā)酵物轉(zhuǎn)化為易被畜禽動物體消化吸收的低分子物質(zhì)的重要媒介。產(chǎn)朊假絲酵母的細胞壁的含量是菌體重量的五分之一，其中有22%的物質(zhì)是糖蛋白、外壁的甘露寡糖、內(nèi)壁的β-葡聚糖具有激發(fā)或增強畜禽動物機體免疫功能的重要物質(zhì)，其中β-葡聚糖含量高達二分之一以上[22-24]。

產(chǎn)朊假絲酵母是生產(chǎn)食用、藥用或飼料用單細胞蛋白的優(yōu)良菌種。其中甘露糖和β-葡聚糖可以為禽類動物增強機體免疫力，是蛋白飼料優(yōu)質(zhì)的發(fā)酵菌種。還含有豐富的酶類，這些酶類在發(fā)酵中能將淀粉和纖維素進行水解，將發(fā)酵物轉(zhuǎn)化為易被畜禽動物體消化吸收的低分子物質(zhì)。

將選取好的菌種經(jīng)過分離、純化后進行鑒定。純化后的酵母取出觀察，其形態(tài)乳白色，平滑，有光澤，邊緣整齊或菌絲狀見圖3圖4:

圖3 純化后的酵母 圖4 純化后的酵母

純化后的酵母接種到250ml裝有100ml液體培養(yǎng)基中設(shè)置溫度29℃，轉(zhuǎn)速160r/min培養(yǎng)24h后關(guān)閉轉(zhuǎn)速繼續(xù)培養(yǎng)8h。觀察液體上層不產(chǎn)醭見圖5，錐形瓶底有菌體沉淀見圖6。

圖5 液體培養(yǎng)后的酵母 圖6 液體培養(yǎng)后的酵母

1.3.6 菌種的生長曲線

將分離純化好的酵母取出接種，將其接種到裝有100mlYPD液體培養(yǎng)基的錐形瓶中用橡膠塞封住瓶口后放入振蕩培養(yǎng)箱中進行振蕩培養(yǎng)，把溫度調(diào)為29℃，轉(zhuǎn)速設(shè)置為160r/min進行振蕩培養(yǎng)，12h后取出備用。

用滅菌移液槍準確吸取培養(yǎng)到生長對數(shù)期的菌液10.0ml，取提前配置好的YPD液體培養(yǎng)基90毫升，放入250ml錐形瓶中，再將菌液放入其中，封口。放入振蕩培養(yǎng)箱中，打開培養(yǎng)箱，把溫度調(diào)為29℃，轉(zhuǎn)速設(shè)置為160r/min進行振蕩培養(yǎng)。

進行時間段取樣，取樣時間分別0、4、8、12、16、20、24、28、32、34、36、40、44h按無菌操作進行取樣，將取得的菌液在波長600nm下測量吸光度。然后繪制生長曲線，該曲線是以菌液吸光度值×稀釋的倍數(shù)為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標。測量后得出產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)液吸光度值和生長曲線，吸光度值表見表1。

表1 產(chǎn)朊假絲酵母不同時間培養(yǎng)液吸光度A

生長曲線見圖7：

圖7 產(chǎn)朊假絲酵母生長曲線

由圖7可知，產(chǎn)朊假絲酵母生長對數(shù)期在4～28h，平穩(wěn)期在28～32h，且在28h時生長對數(shù)期達最大吸光值6.470。32h后產(chǎn)朊假絲酵母生長開始衰退。

1.3.7 尿素對發(fā)酵結(jié)果的影響

在金刺梨果渣發(fā)酵預(yù)實驗過程中，金刺梨的含氮量較少，無法滿足微生物生長需求，也不能利用無機氮源合成蛋白質(zhì)。因此在發(fā)酵過程重要加入少量的尿素[16]。

實驗稱取烘干后的金刺梨果渣果渣10g，添加不同尿素1.5%、2%、2.5%，以接種量10%、料液比1∶1制成固體培養(yǎng)基進行單因素實驗，在自然pH環(huán)境下，29.5℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵4d。發(fā)酵后在烘箱中60℃烘干，測定發(fā)酵后的蛋白質(zhì)。其發(fā)酵因素及其發(fā)酵后蛋白質(zhì)和氨基酸的含量如圖8所示。

圖8 不同尿素對發(fā)酵結(jié)果的影響

由圖8可知，當尿素的添加量為2%時，蛋白質(zhì)和氨基酸的含量最高。

1.3.8 不同接種量對發(fā)酵結(jié)果的影響 實驗稱取烘干后的金刺梨果渣果渣10g，尿素2%，以不同接種量10%、12%、15%、17%、20%料液比1：1制成固體培養(yǎng)基進行單因素實驗，在自然pH環(huán)境下，29.5℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵4d。發(fā)酵后在烘箱中60℃烘干，測定發(fā)酵后的蛋白質(zhì)。其發(fā)酵因素及其發(fā)酵后蛋白質(zhì)和氨基酸的含量見圖9。

圖9 不同接種量對發(fā)酵結(jié)果的影響

由圖9可知，當接種量為15%時，蛋白質(zhì)和氨基酸的含量最高。

1.3.9 不同料液比對發(fā)酵結(jié)果的影響

實驗稱取烘干后的金刺梨果渣果渣10g，尿素2%，以接種量10%，以不同料液比1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5制成固體培養(yǎng)基進行單因素實驗，在自然pH環(huán)境下，29.5℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵4d。發(fā)酵后在烘箱中60℃烘干，測定發(fā)酵后的蛋白質(zhì)。其發(fā)酵因素及其發(fā)酵后蛋白質(zhì)和氨基酸的含量見圖10。

由圖10可知，當料液比為1:2時，蛋白質(zhì)和氨基酸的含量最高。

圖10 不同料液比對發(fā)酵結(jié)果的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 金刺梨果渣發(fā)酵前各營養(yǎng)成分

金刺梨果渣發(fā)酵前各營養(yǎng)成分指標和含量見表2。

表2 金刺梨果渣發(fā)酵前營養(yǎng)成分

2.2 金刺梨果渣發(fā)酵后各營養(yǎng)成分

發(fā)酵以金刺梨果渣10g，尿素2%，接種量15%,料液比1∶2配制成固體培養(yǎng)基，然后將其進行發(fā)酵。發(fā)酵后，對金刺梨果渣發(fā)酵物再次進行營養(yǎng)成分測定，結(jié)果詳情見表3。

表3 發(fā)酵后金刺梨果渣營養(yǎng)成分含量

由表3可知，金刺梨果渣發(fā)酵物中的蛋白質(zhì)含量和氨基酸含量在發(fā)酵后會增加，發(fā)酵后的總糖和維生素C的含量減少。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本試驗選取產(chǎn)朊假絲酵母對金刺梨果渣進行發(fā)酵實驗探究，將金刺梨果渣制成固態(tài)培養(yǎng)基進行發(fā)酵，并對金刺梨果渣發(fā)酵前后的營養(yǎng)成分進行測定對比。結(jié)果顯示，發(fā)酵以金刺梨10 g，尿素2%，接種量15%，料液比1：2配制成固體培養(yǎng)基進行發(fā)酵4d。金刺梨果渣在發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量由7.62mg/g提高到17.21mg/g，提高了126%，總糖由14%下降到2.6%，維生素C由6.53 mg/g下降到1.87 mg/g下降了71%，總氨基酸4.682 mg/g提高到8.732 mg/g。提高了86.5%。金刺梨果渣發(fā)酵后蛋白質(zhì)和氨基酸都得到提高，并且蛋白質(zhì)和氨基酸都是蛋白飼料的重要指標。因此金刺梨通過發(fā)酵后是一種理想的蛋白飼料。

3.2 討論

就目前來說，金刺梨加工后留下的果渣，雖然也含有較高的氨基酸，維生素和礦物營養(yǎng)元素，但因其果渣處理工藝滯后，動物采食性差，大多數(shù)金刺梨加工廠都選擇將金刺梨果渣廢棄處理。將金刺梨果渣經(jīng)過產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵制成蛋白飼料后，蛋白質(zhì)和氨基酸的含量得到大幅提高，并且產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵制成蛋白飼料中含有甘露寡糖和β-葡聚，糖能激發(fā)或增強畜禽動物機體免疫功能。因此金刺梨果渣發(fā)酵蛋白飼料在畜禽動物中應(yīng)用價值很高，且有助于解決我國飼料資源短缺的問題。

但因該工藝在初始研究階段，在動物生產(chǎn)性能、腸道功能、免疫能力和繁殖性能等方面的研究，也有待進一步開展，且在動物生產(chǎn)中的合理添加量及添加方式也需進行深入研究，以期促進金刺梨果渣在飼料產(chǎn)業(yè)中的廣泛應(yīng)用。