應(yīng)用數(shù)據(jù)集GSE63514和GSE67522對宮頸癌關(guān)鍵基因的篩選研究

王曉旋，馬雪艷，劉云春

應(yīng)用數(shù)據(jù)集GSE63514和GSE67522對宮頸癌關(guān)鍵基因的篩選研究

王曉旋，*馬雪艷，*劉云春

（大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南，大理 671000）

通過DAVID網(wǎng)站進行上調(diào)基因的GO分析，借助STRING工具建立上調(diào)基因的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)，使用Cytoscape軟件里的MCODE插件篩選出宮頸癌關(guān)鍵基因；借助基因表達譜交互分析數(shù)據(jù)庫（GEPIA）和人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（HPA）探討宮頸癌關(guān)鍵基因在宮頸癌組織的表達及預(yù)后情況。通過兩個數(shù)據(jù)集獲取12個共同上調(diào)基因，篩選出TRIP13、ATAD2、POLQ、KIFC1、EXO1、MELK、RMI2、KNTC1、UHRF1這9個關(guān)鍵基因；GO功能富集分析提示宮頸癌關(guān)鍵基因功能的作用主要集中在DNA修復(fù)、免疫球蛋白基因的體細胞超突、鏈置換反應(yīng)及DNA合成修復(fù)等過程中；基因驗證結(jié)果提示：篩選的9個宮頸癌關(guān)鍵基因在宮頸癌組織的表達均較正常組織高（＜0.05）；EXO1、KNTC1、RMI2與患者不良預(yù)后相關(guān)；免疫組化結(jié)果顯示KNTC1、RMI2在宮頸鱗癌組織表達較癌旁組織高。本研究通過生物信息學(xué)篩選出的與宮頸癌相關(guān)的9個關(guān)鍵基因，期待成為宮頸癌診斷和治療的潛在靶點，并為功能性實驗的開展提供理論依據(jù)。

宮頸癌；生物信息學(xué)；關(guān)鍵基因

宮頸癌（cervical cancer）是全球女性中第二常見的癌癥類型，僅次于15-44歲女性乳腺癌的患病率。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，近年來，宮頸癌患者增長率呈現(xiàn)遞增且年輕化的態(tài)勢[1]。目前研究證實高危型人乳頭狀瘤病毒(Human papilloma virus, HPV)的持續(xù)感染是宮頸癌的主要致病因素，而性生活活躍或不潔性生活史、吸煙、社會綜合因素等也是重要誘發(fā)因素[2-3]。目前，宮頸癌常規(guī)治療手段為手術(shù)治療和放化療，對于早期患者確有一定成效，但對于進展期患者則效果甚微，同時存有毒副作用大和腫瘤耐藥等難題?；顧z樣本的顯微鏡觀察一直作為宮頸癌篩查和診斷的主要手段，但這種技術(shù)往往會因主觀因素和技術(shù)差異存有偏差。盡管陸續(xù)有許多創(chuàng)新型技術(shù)用于癌癥早篩階段，但能夠在微觀水平上檢測到時通常為時已晚，很難成功干預(yù)。因此，尋找更為準(zhǔn)確且穩(wěn)定的生物學(xué)靶點變得尤為重要，從基因?qū)用嫒ふ倚滦蜕飿?biāo)志物成為了“熱門工程”之一[4]。

隨著數(shù)據(jù)時代的發(fā)展，怎樣在龐大、交雜的各種數(shù)據(jù)信息中提取出符合自己想要的信息是亟待解決的問題。隨著數(shù)據(jù)庫挖掘技術(shù)的不斷演進，生物信息學(xué)也受到越來越多人的關(guān)注，研究人員將已有的研究成果和技術(shù)信息收納并儲存在數(shù)據(jù)庫中，便于可以迅速從海量信息中挖掘出有效信息和生物學(xué)知識。本項目便是利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫了解基因在癌癥類型中的表達譜，分析基因表達與患者預(yù)后之間的相關(guān)性，從而便于科研人員開拓研究和治療領(lǐng)域的新思路[5-7]。本項研究旨在借助基因芯片提供的數(shù)據(jù)，篩選出與宮頸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵基因，為宮頸癌的診治提供參考依據(jù)，期待成為臨床治療的新靶點。

1 資料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)信息來源

美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）是一個包含豐富基因信息和大量生物醫(yī)學(xué)文獻的國際公共數(shù)據(jù)庫。宮頸癌芯片數(shù)據(jù)是由NCBI-GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫下載，篩選物種為人且排除宮頸內(nèi)膜癌等其他癌種的干擾，最終選取兩個宮頸癌基因芯片：GSE63514和GSE67522。GSE63514包含28個宮頸癌組織和24個癌旁組織，GSE67522包含20個宮頸癌組織和22個癌旁組織。

1.2 共同上調(diào)基因的獲取

GEO2R(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)是一個基于limma包和GEOquery R包的工具，用于識別宮頸癌和正常樣本之間的數(shù)據(jù)集。由GEO2R在線分析來自GSE63514和GSE67522數(shù)據(jù)集的樣本信息，定義劃分腫瘤組織和癌旁組織，進一步分析得出差異基因表達數(shù)據(jù)表并下載，整理后篩選|logFC|>2且＜0.05的基因。將logFC>2的基因命為上調(diào)基因，并借助軟件Venn（http://bioinformatics.psb.ugent.be/cgi-bin/liste/Venn）繪制來自兩個數(shù)據(jù)集的共同上調(diào)的基因。

1.3 GO功能富集分析

DAVID（database for annotation，visualization and integrated discovery）網(wǎng)站整合了大量生物數(shù)據(jù)信息和在線分析工具，借助此數(shù)據(jù)庫可快速將大規(guī)?；蚧虻鞍走M行處理并得出綜合性生物功能注釋信息。將獲得基因數(shù)據(jù)集導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫中進行GO功能分析，以＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 PPI和關(guān)鍵基因的選取

STRING(https://www.string-db.org/)為在線分析蛋白相互作用的數(shù)據(jù)庫，此數(shù)據(jù)庫包含近百萬種蛋白類型和蛋白之間相互作用信息。將獲得的基因數(shù)據(jù)集導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫中可得出PPI繪制圖，通過連線和節(jié)點展示蛋白間相互作用。然后下載Cytoscape軟件，通過Cytoscape軟件里MCODE插件篩選出與宮頸癌相關(guān)性較大的關(guān)鍵基因，將篩選條件設(shè)置為：Degree Cutoff =2，Max. Depth = 100，K－Core = 2，Node Score cutoff =0.2。

1.5 關(guān)鍵基因在宮頸癌與癌旁組織表達分析

將篩選出的關(guān)鍵基因借助基因表達譜交互分析數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/，GEPIA）進行在線分析，該數(shù)據(jù)庫包含來自TCGA和GTEx項目的9736個腫瘤和8587正常樣本的RNA測序表達數(shù)據(jù)，可快速便捷分析基因在宮頸癌與癌旁組織之間的表達差異，將繪圖類型設(shè)置為Boxplot且以＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。選擇Survival plots將篩選出的關(guān)鍵基因逐個進行分析，在線繪制并獲得關(guān)鍵基因的生存曲線，分析與患者預(yù)后的相關(guān)性，以＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6 免疫組化染色結(jié)果分析

人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http://www.proteinatlas.org/，HPA）包含了上萬種蛋白在組織和細胞的表達情況，該數(shù)據(jù)庫所記錄的信息為研究人員用免疫檢測技術(shù)檢測蛋白在細胞、組織（癌和癌旁組織）和腫瘤種的表達情況。該數(shù)據(jù)庫具有可迅速獲取蛋白表達情況的優(yōu)勢，是一個大規(guī)模蛋白質(zhì)研究項目，主要為繪制人體組織和細胞中表達基因編碼的蛋白位置，但該數(shù)據(jù)庫也存在收集組織不充分導(dǎo)致可獲取信息較少的缺點。

2 結(jié)果

2.1 上調(diào)基因篩選結(jié)果

在此項研究中，借助GEO2R在線分析工具將GSE63514（28個宮頸癌組織和24個癌旁組織）和GSE67522（20個宮頸癌組織和22癌旁組織）兩個芯片中分別提取了上調(diào)基因68個和52個。其中在兩個基因芯片中共上調(diào)基因有12個（圖1，表1）。

圖1 GSE63514和GSE67522基因芯片數(shù)據(jù)及共同上調(diào)基因

表1 12個表達上調(diào)的基因

Table 1 12 Up-regulated genes

基因名稱 上調(diào)POLQ、EXO1、MELK、RMI2、ATAD2、KIFC1、ZIC2、TRIP13、UHRF1、CDKN2A、KNTC1、NUP210

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成圖及關(guān)鍵基因的篩選結(jié)果

將得到的12個共上調(diào)基因通過STRING得到蛋白質(zhì)之間相互作用圖（圖2A），發(fā)現(xiàn)ZIC2、NUP21、CDKN2A三個基因與其他基因之間無互作關(guān)系。借助Cytoscape程序里的MCODE插件得到一簇相對聯(lián)系密集的基因集，將它單獨呈現(xiàn)，可以看到有9個聯(lián)系緊密的基因集團[ATAD2（三磷酸腺苷酶家族蛋白2）、EXO1(核酸外切酶1)、KIFC1(驅(qū)動蛋白家族成員 C1)、KNTC1（著絲點關(guān)聯(lián)蛋白1）、MELK（母體胚胎亮氨酸拉鏈激酶）、POLQ(DNA聚合酶θ)、RMI2（RecQ解旋酶介導(dǎo)的基因組穩(wěn)定性蛋白2）、TRIP13（甲狀腺受體相互作用蛋白13）、UHRF1（泛素樣含PHD和環(huán)指域1）]，我們將其鑒定為關(guān)鍵基因（圖2B）。

注：A：表達上調(diào)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析圖（圓圈代表基因，線代表蛋白之間相互作用）；B：9個關(guān)鍵基因示意圖（方塊代表基因）

2.3 9個關(guān)鍵基因的GO功能分析結(jié)果

由DAVID軟件分析9個關(guān)鍵基因，其GO功能分析結(jié)果從生物學(xué)過程（BP）、分子功能（MF）及細胞成分（CC）三個層面進行分析（表2）。在BP水平上，結(jié)果顯示其功能發(fā)揮主要集中在DNA修復(fù)、免疫球蛋白基因的體細胞超突變、鏈置換反應(yīng)、雙聯(lián)斷裂修復(fù)等過程中；在MF水平，其功能發(fā)揮主要集中于ATP結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合；在CC水平，其功能發(fā)揮主要集中于細胞核。

表2 關(guān)鍵基因的GO功能分析

Table 2 GO function analysis of key genes

類別GO編碼GO名稱基因基因數(shù)該基因占所在通路的比重（%）P值 BP0006281DNA修復(fù)過程POLQ, EXO1, UHRF1325.00＜0.05 0016446免疫球蛋白基因的體細胞超突變POLQ, EXO1216.67＜0.05 0000732鏈置換反應(yīng)RMI2, EXO1216.67＜0.05 0000731DNA合成和修復(fù)RMI2, EXO1216.67＜0.05 0006302雙鏈斷裂修復(fù)POLQ, TRIP13216.67＜0.05 MF0005524ATP結(jié)合POLQ, MELK, KIFC1, ATAD2, TRIP13541.67＜0.05 0003682染色質(zhì)結(jié)合POLQ, EXO1, ATAD2325.00＜0.05 CC0005634細胞核RMI2, MELK, ZIC2, EXO1,1083.35＜0.05

2.4 關(guān)鍵基因在宮頸癌組織及癌旁組織表達結(jié)果

將篩選得到的9個核心基因通過GEPIA數(shù)據(jù)庫進行表達量分析，結(jié)果顯示9個關(guān)鍵基因在宮頸癌組織的表達量較正常組織高（圖3），且表達差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜ 0.05）。

2.5 關(guān)鍵基因與患者預(yù)后之間關(guān)系

GEPIA數(shù)據(jù)庫可在線獲悉基因與患者生存預(yù)后的關(guān)系。我們將關(guān)鍵基因依次分析后結(jié)果表明：EXO1、KNTC1、RMI2的生存分析具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），提示當(dāng)EXO1、KNTC1、RMI2存在高表達時與患者的不良預(yù)后有關(guān)（圖4）。

2.6 KNTC1、RMI2蛋白在宮頸鱗癌組織和癌旁組織的免疫組化結(jié)果

將與患者不良預(yù)后相關(guān)的EXO1、KNTC1、RMI2基因在蛋白水平上進一步研究，借助HPA數(shù)據(jù)庫提取其在宮頸鱗癌組織和癌旁組織的免疫組化結(jié)果特征圖（圖5），KNTC1、RMI2基因在組織中表達結(jié)果如下：KNTC1蛋白在宮頸鱗癌組織中染色陽性率＞75%，染色強度強，而在正常組織染色陽性率＜25%，染色強度弱；RMI2蛋白在宮頸鱗癌組織中。染色陽性率＞75%，染色強度強，在正常組織中染色陽性率為25%-50%，染色強度相對較弱。通過免疫組化染色結(jié)果提示，相比于正常組織，KNTC1、RMI2蛋白在宮頸鱗癌組織中較癌旁組織表達量高，KNTC1蛋白表達主要定位于細胞膜或細胞質(zhì)，RMI2蛋白表達主要定位于細胞核。

注：A-B:KNTC1在正常宮頸組織表達情況；C-D：KNTC1在宮頸鱗癌組織表達情況；E-F:RMI2在正常宮頸組織表達情況；J-H：RMI2在宮頸鱗癌組織表達情況

3 討論

宮頸癌作為女性常見惡性腫瘤，不僅危害著女性的健康安全同時還帶來了嚴重的經(jīng)濟負擔(dān)。因此如何提高早篩率、增加治愈率一直以來都是其研究熱點[8]。近年來，研究人員除了增加常規(guī)篩查干預(yù)措施外，還致力對生物標(biāo)志物的探索，從分子學(xué)角度找尋新的診斷和治療靶點[9]。

TRIP13可作為多種癌癥的促進因子，如在卵巢癌中可通過 Notch信號介導(dǎo)促進癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[10]，在肝細胞癌中可通過介導(dǎo) TGF-β1/smad3通路促進癌癥發(fā)生發(fā)展等[11]。POLQ常與其他幾種參與復(fù)制的基因（CDC45、CDC6、CDT1、SLD5、 MCM2、MCM7）產(chǎn)生激發(fā)復(fù)制效應(yīng)，用一種錯誤模式對DNA損傷進行修復(fù)，造成基因組的不穩(wěn)定，從而激發(fā)某些癌癥的發(fā)生發(fā)展，如結(jié)直腸癌[12]。KIFC1不僅可以通過PI3K/AKT通路還可通過Jak/Stat途徑來促進肝癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[13],同時作為一種活性多肽，可通過PI3K/AKT信號通路促進膽管癌的惡性生物學(xué)行為[14]，由此可見，KIFC1可通過PI3K/AKT通路參與多種癌癥發(fā)展進程。MELK作為一種激酶，可參與許多生物學(xué)過程，如細胞循環(huán)、細胞凋亡、RNA加工并磷酸化一些特定底物等[15]。在子宮內(nèi)膜癌中，MELK基因可被E2F1激活，與MLST8相互作用共同激活mTORC1/2通路來促進子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖[16]。在胃癌中，MELK可通過作用于 FAK/Paxillin通路來促進胃癌的發(fā)生發(fā)展[17]。KNTC1為一種著絲點關(guān)聯(lián)蛋白，是有絲分裂檢查點組成部分，確保有絲分裂過程中染色體的正常分離[18]。在食管鱗狀細胞癌中，KNTC1是高表達的且與有絲分裂中紡錘體的增加和DNA修復(fù)減少、錯配修復(fù)有關(guān)[19]。有研究表明，敲低 KNTC1可以抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和腫瘤的發(fā)生，促進細胞凋亡[20]。

本研究基于對GSE67522和GSE63514兩個宮頸癌基因芯片數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)共同上調(diào)的基因有12個（見圖1，表1），并用STRING工具得到蛋白之間的互作圖（見圖2A）。通過Cytoscape軟件里MCODE插件得到TRIP13、ATAD2、POLQ、KIFC1、EXO1、MELK、RMI2、KNTC1、UHRF1為與宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)的基因（見圖2B）。通過文獻了解到，數(shù)據(jù)庫篩選得到的9個關(guān)鍵基因已參與多種癌癥發(fā)生發(fā)展過程，但與宮頸癌之間研究較少，本研究恰為該空缺填補一定數(shù)據(jù)信息，為今后進一步研究與宮頸癌之間的關(guān)系提供理論依據(jù)，也為功能性實驗的開展提供可行性指導(dǎo)。

ATAD2作為一種染色質(zhì)修飾酶蛋白，在一些腫瘤中參與調(diào)控染色質(zhì)動力活性，基因組轉(zhuǎn)錄活性和細胞凋亡過程，調(diào)節(jié)多種癌癥演變進程，ATAD2在多種癌癥組織中呈高表達，如乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細胞癌和卵巢癌[21-24]。近期研究發(fā)現(xiàn)KIFC1在卵巢癌中是高表達的，可被當(dāng)做預(yù)測卵巢癌侵襲過程的潛在生物標(biāo)記物[25]，KIFC1作為驅(qū)動蛋白家族的一員，在肝癌組織中呈高表達，且可通過促進HMGA1轉(zhuǎn)錄活性進而促進癌癥演變進程[26]。RMI2是一種RecQ解旋酶介導(dǎo)的基因組穩(wěn)定性蛋白，對基因的穩(wěn)定性發(fā)揮著重要的作用，它的突變常與Bloom綜合征有關(guān)[27]。關(guān)于RMI2與癌癥之間的關(guān)系報道較少，研究人員發(fā)現(xiàn)RMI2在肺癌組織中的表達較正常組織高，且隨著肺癌TNM分期的增加表達量也隨之增加[28]。UHRF1是一種與腫瘤發(fā)生相關(guān)的核蛋白[29]，可調(diào)節(jié)基因表達和進行染色質(zhì)修飾，當(dāng)過表達時，可驅(qū)動DNA低甲基化、促進腫瘤發(fā)展。已有報道表明，在胃癌、膀胱癌和肝細胞癌組織中存在UHRF1高表達[30]。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫將TRIP13、ATAD2、POLQ、KIFC1、EXO1、MELK、RMI2、KNTC1、UHRF1這9個基因進行了表達量的驗證，結(jié)果提示在宮頸癌和癌旁組織中表達差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（見圖3）。通過閱讀文獻發(fā)現(xiàn)，盡管這些關(guān)鍵基因與多種癌癥之間關(guān)系已有報道，但對于在宮頸癌組織中表達及發(fā)揮的生物學(xué)功能研究甚少，本項目篩選結(jié)果可為研究人員開拓新的研究領(lǐng)域提供方向。

EXO1作為一種核酸外切酶，在誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù)中起到關(guān)鍵作用。在乳腺癌中，EXO1高表達與促癌作用以及患者預(yù)后不良有關(guān)，可能是通過調(diào)節(jié)細胞周期所致。在肝癌中，EXO1表達量較高且與患者的預(yù)后不良相關(guān)。本研究生存分析結(jié)果顯示EXO1、KNTC1、RMI2高表達患者的生存時間較低表達患者短（見圖4），但目前EXO1、KNTC1、RMI2與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系報道較少。

綜上所述，本研究基于生物信息學(xué)篩選出TRIP13、ATAD2、POLQ、KIFC1、EXO1、MELK、RMI2、KNTC1、UHRF1這9個可能與宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因。功能發(fā)揮主要與DNA修復(fù)過程、免疫球蛋白基因的體細胞超突變過程、鏈置換反應(yīng)過程、雙聯(lián)斷裂修復(fù)過程等相關(guān)（見表2）。EXO1、KNTC1、RMI2與患者不良預(yù)后相關(guān)（見圖4），免疫組化結(jié)果進一步明確了KNTC1、RMI2在宮頸鱗癌組織的表達量要比癌旁組織高（見圖5）。本項研究是基于數(shù)據(jù)庫篩選得到的這9個關(guān)鍵基因，雖缺乏實驗基礎(chǔ)的驗證，但填補了宮頸癌候選基因的篩選這一空白，后續(xù)還需功能性實驗來增加其可靠性，期望能成為宮頸癌診斷和治療的靶點。

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SCREENING RESEARCH ON KEY GENES OF CERVICAL CANCER BASED ON DATA SETS GSE63514 AND GSE67522

WANG Xiao-xuan1，*MA Xue-yan1，*LIU Yun-chun1

（School of Basic Medical Sciences, Dali University, Dali, Yunnan 671000, China）

The GO analysis of the up-regulated genes are carried out through the DAVID website, the protein-protein interaction network diagram (PPI) of the up-regulated genes is established with the STRING tool, and the key genes are screened out using the MCODE plug-in in Cytoscape software. Finally, the key genes in cervical cancer tissues are explored by Gene Expression Profile Interactive Ananlysis（GEPIA）and the Human protein database（HPA). Twelve common up-regulated genes are obtained from two data sets, then nine key genes TRIP13, ATAD2, POLQ, KIFC1, EXO1, MELK, RMI2, KNTC1, UHRF1 are screened out. GO function enrichment analysis suggests the main functions are mainly concentrated in the DNA repair process, the somatic hypermutation process of immunoglobulin genes, strand replacement reaction, DNA synthesis repair, and so on. The verification results show that the expression of nine key genes in cervical cancer tissues is higher than that in normal tissues (＜0.05), and EXO1, KNTC1, and RMI2 are related to the poor prognosis of patients. The immunohistochemical results of KNTC1 and RMI2 proteins recorded in the database suggest that the expression level of cervical squamous cell carcinoma tissues is higher than that of adjacent tissues. The nine key genes related to cervical cancer screened out in this study through bioinformatics may be the potential targets for treatment and provide a theoretical basis for the development of functional experiments.

cervical cancer; bioinformatics; key genes

1674-8085（2022）03-0034-07

R737.33

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2022.03.006

2021-07-02；

2022-01-20

國家自然科學(xué)配套基金項目(81260627)

王曉旋(1996-)，女，山東泰安人，碩士生，主要從事分子生物學(xué)研究(Email:18263882880@163.com)；

*劉云春(1960-)，女，云南昆明人，教授，博士，主要從事分子生物學(xué)研究(Email:jiayao812@aliyun.com)；

*馬雪艷(1990-)，女，云南巍山人，副教授，博士，主要從事分子生物學(xué)研究(Email:987032377@qq.com).