miR-21和VEGF在結腸癌中的表達變化及臨床意義

劉艷紅 陳文霞 屈重行 李琨琨 姜媛媛 吳慧麗

(鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院消化內科，河南 鄭州 450007)

結腸癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率逐年上升，由于腫瘤具有高度侵襲性及轉移性導致治療效果降低及患者預后不良，因而早期診斷及治療有助于改善患者預后〔1～3〕。微小RNA(miRNA)在腫瘤中異常表達并可能參與癌癥發(fā)生及發(fā)展過程，研究表明微小RNA-21(miR-21)在乳腺癌中呈高表達，并可能作為乳腺癌診斷及判斷預后的重要標志物〔4〕。但miR-21在結腸癌發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機制尚未完全闡明。血管內皮生長因子(VEGF)在結腸癌中呈高表達并可參與結腸癌發(fā)生及發(fā)展過程〔5〕。研究表明miR-21可能通過調控VEGF表達從而參與膠質瘤發(fā)生及發(fā)展〔6〕。但miR-21是否可通過調控VEGF表達從而參與結腸癌發(fā)生及發(fā)展尚未可知。本研究主要探討miR-21、VEGF在結腸癌中的表達并探究其可能臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年5月至2017年2月鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院收治的80例結腸癌患者，年齡45～78歲，平均(63.64±12.03)歲，男43例，女37例，所有患者經病理證實為結腸癌，51例發(fā)生淋巴結轉移，29例未發(fā)生淋巴結轉移；中高分化32例，低分化48例；TNM分期中Ⅰ～Ⅱ期患者30例，Ⅲ～Ⅳ期50例。根據miR-21、VEGF表達量的平均值將結腸癌患者分為miR-21高表達組(55例)、miR-21低表達組(25例)、VEGF高表達組(50例)、VEGF低表達組(30例)。 納入標準：術前未接受放化療治療；腫瘤分期符合國際抗癌聯(lián)盟標準。排除標準：合并其他惡性腫瘤；肝、腎等重要器官嚴重受損；生存期不超過3個月。術中切除結腸癌組織及其相應癌旁組織，液氮中保存，術后轉移至-80℃超低溫冰箱保存。

1.2主要試劑 miR-21、VEGF mRNA引物由廣州Invitrogen公司合成；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉錄與實時熒光定量-聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

1.3實時熒光定(qRT)-PCR檢測miR-21、VEGF mRNA的表達水平 采用Trizol法提取結腸癌組織及癌旁組織中的總RNA，應用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度與純度。參照反轉錄試劑盒將總RNA合成cDNA。miR-21正向引物5′-ATGGGCTGTCTGACAAGCTA-3′，反向引物5′-TCTCGCATAGTACGCTAGCT-3′；VEGF正向引物5′-TCTACCTCCACCATGCCAAG-3′，反向引物5′-CACAGGACG GCTTGAAGATG-3′；U6正向引物5′-ATTGGAACGATACA GAGAAGATT-3′，反向引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′；GAPDH正向引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。qRT-PCR反應體系：cDNA 2 μl，Real-Time Master Mix 10 μl，正反向引物各1 μl，RNase-Free ddH2O補足體系至20 μl；反應條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循環(huán)40次。miR-21以U6為內參，VEGF以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-21、VEGF mRNA相對表達量。

1.4隨訪 患者均進行3年隨訪，隨訪方式為電話或復查，統(tǒng)計患者生存時間及生存率。

1.5統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、方差分析、χ2檢驗；Pearson法、Kaplan-Meier、Log-Rank法、COX比例風險回歸。

2 結 果

2.1結腸癌組織中miR-21、VEGF mRNA表達量比較 與癌旁組織比較，結腸癌組織中miR-21、VEGF mRNA表達量顯著升高(P<0.001)，見表1。

表1 結腸癌組織中miR-21、VEGF mRNA的表達量比較

2.2miR-21、VEGF表達量與結腸癌患者臨床病理參數(shù)的相關性 miR-21、VEGF與TNM分期、淋巴結轉移、分化程度密切相關(P<0.05)，見表2。

表2 miR-21、VEGF表達量與結腸癌患者臨床病理參數(shù)的相關性〔n(%)〕

2.3結腸癌患者miR-21、VEGF表達量的相關性 miR-21與VEGF呈正相關(r=0.619，P=0.000)。

2.4miR-21、VEGF表達量與結腸癌患者預后的相關性 miR-21低表達組生存率為52.32%，miR-21高表達組生存率為22.10%；VEGF高表達組生存率為18.35%，VEGF低表達組生存率為42.10%，miR-21低表達組與miR-21高表達組生存率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，VEGF高表達組與VEGF低表達組生存率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 miR-21、VEGF表達量與結腸癌患者預后的相關性

2.5影響結腸癌患者預后的多因素分析 淋巴結轉移、分化程度、miR-21、VEGF是影響結腸癌患者預后的危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 影響結腸癌患者預后的多因素分析

3 討 論

miRNA在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用，既往研究顯示miRNA可通過調控下游靶基因表達從而參與結腸癌發(fā)生及發(fā)展過程〔7～9〕。但仍有部分miRNA在結腸癌發(fā)生過程中的作用機制尚未闡明。

miR-21下調可抑制結腸癌細胞增殖、遷移及侵襲并可抑制細胞凋亡〔10〕。研究表明miR-21在肺癌患者中表達上調并可能作為肺癌早期診斷的生物學指標〔11〕。miR-21在肝癌組織中呈高表達，其高表達量與患者惡性臨床病理特征密切相關〔12〕。miR-21在大腸癌中呈高表達并可參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程〔13〕。本研究結果說明隨著結腸癌患者TNM分期的增加、淋巴結轉移及分化程度的增加miR-21的表達量顯著升高。提示miR-21高表達量可參與結腸癌發(fā)生及發(fā)展過程，并在結腸癌發(fā)生過程中發(fā)揮重要調控作用。

VEGF在結腸癌組織中呈高表達，其表達量與患者臨床病理特征密切相關〔14，15〕。研究表明VEGF在肺癌中呈高表達，其高表達量與肺癌疾病嚴重程度密切相關，并可能作為肺癌診斷的有效指標〔16，17〕。本研究結果提示VEGF在結腸癌中高表達并可能參與結腸癌發(fā)生及發(fā)展過程。提示miR-21可能通過促進VEGF表達從而參與結腸癌發(fā)生及發(fā)展過程。同時本研究結果提示miR-21、VEGF表達量升高預示結腸癌患者預后不良，miR-21、VEGF表達量升高可能增加結腸癌的發(fā)生風險并可能作為判斷患者預后的重要指標。

綜上，miR-21、VEGF在結腸癌中呈高表達，二者呈正相關且與患者臨床病理參數(shù)密切相關，并可能作為結腸癌診斷及判斷患者預后的重要生物標志物。但關于miR-21、VEGF在結腸癌發(fā)生及發(fā)展過程中的具體作用機制仍需體內實驗與體外細胞實驗進行驗證。