參地顆粒對(duì)C-BSA大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及足細(xì)胞損傷的干預(yù)作用*

韓佳月，項(xiàng)建軍，金華

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 安徽合肥 230000 2 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230000

膜性腎?。∕embranous nephropathy，MN）是一組由免疫復(fù)合物介導(dǎo)的足細(xì)胞病變，臨床表現(xiàn)為大量蛋白尿，為腎病綜合征最常見的病理類型之一[1]。MN傳統(tǒng)治療為激素聯(lián)合免疫抑制劑，但部分患者出現(xiàn)感染、股骨頭壞死等副作用[2]，且病情易反復(fù)，最終進(jìn)展至終末期腎?。‥SRD），對(duì)患者生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。近年來發(fā)現(xiàn)[3-4]，持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）是足細(xì)胞損傷的重要因素，而自噬對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，該機(jī)制有望成為防治足細(xì)胞病變的重要途徑。大鼠尾靜脈注射陽離子化牛血清白蛋白（C-BSA）是制作MN的經(jīng)典模型。中醫(yī)藥治療MN體現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，既往研究證實(shí)參地顆粒在治療腎小球疾病中已取得顯著療效[5-6]。本研究將進(jìn)一步觀察參地顆粒對(duì)C-BSA大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及足細(xì)胞損傷的干預(yù)作用，從而探討其治療MN的作用機(jī)理。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2月齡清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號(hào)：SCXK（魯）2019-0003），適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

參地顆粒（人參、熟地黃、茯苓、五味子、桑螵蛸、雞內(nèi)金、川芎），由安徽省中醫(yī)院制劑中心研制（皖藥制字BZ20080025），每袋顆粒劑10g，含生藥劑量 34 g。纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司），國藥準(zhǔn)字：H20040217，每片80mg。陽離子化牛血清白蛋白（C-BSA）購自北京索萊寶科技有限公司（批號(hào)：725M036）。弗氏不完全佐劑（F5506）購自Sigma公司（批號(hào)SLBL9742V）。尿蛋白濃度測定試劑盒，購自南京建成公司（批號(hào)：20201204）。

3 模型建立及分組

采用單純隨機(jī)抽樣法將40只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、參地顆粒組、纈沙坦組4組，每組各10只。除正常組外，其余30只大鼠均采用大鼠尾靜脈注射C-BSA建立MN模型[7]：預(yù)免疫：取C-BSA 100mg溶解于生理鹽水15mL中與等量不完全弗氏佐劑混合，充分乳化。取混合液1ml分別在 40 只大鼠雙側(cè)腋下、腹股溝作多點(diǎn)皮下注射，隔日1次，共3次。正式免疫：將C-BSA按照16mg·kg-1·d-1尾靜脈注射，每周3次，連續(xù)4周。用代謝籠中收集24h尿液進(jìn)行尿蛋白檢測，按24h尿蛋白量≥20mg視為建模成功，＜20mg者剔除。正常組大鼠以相同的注射方式注射等體積生理鹽水。

4 給藥方法

造模成功后開始灌胃，正常組、模型組均給予10ml/kg·d 0.9%的氯化鈉注射液灌胃；參地顆粒組給予參地顆粒水溶液按4.0g/kg·d灌胃；纈沙坦組將纈沙坦膠囊混懸液按20mg/kg·d灌胃。3ml/次，1次/d，連續(xù)給藥8周。

5 標(biāo)本采集及檢測方法

給藥8周后代謝籠收集大鼠24h尿液，用比色法測定尿蛋白濃度（24h尿蛋白量＝尿蛋白濃度×24h尿量）。2%的戊巴比妥麻醉大鼠，摘取右側(cè)腎臟放入凍存管內(nèi)，投放到液氮中，再轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱保存，以備Western blot檢測。

Western blot檢測方法：取100mg腎組織加入1ml組織裂解液（RIPA）及蛋白酶抑制劑制備組織勻漿，10000r/min離心40min，收集上清液，提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測定蛋白含量。100℃變性10min，每組取等量蛋白質(zhì)經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。10%脫脂奶粉-TBST溶液室溫封閉4h后，置入加有一抗的10%奶粉-TBST，4℃冰箱孵育過夜（一抗稀釋比例GRP78、CHOP為1:500；Nephrin、Podocalyxin為1:1000；β-actin為1:1000）；次日用TBST漂洗后加入HRP標(biāo)記的二抗（稀釋比例為1:1000），室溫孵育2h；TBST漂洗，加入ECL后曝光；用Fluors凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶，蛋白的相對(duì)含量以目的蛋白吸光密度×面積與β-actin條帶的比值表示。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；若資料不符合正態(tài)分布或方差不齊則采用非參數(shù)檢驗(yàn)；P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠24hUpro比較

模型組大鼠的24hUpro顯著高于正常組（P＜0.05）。與模型組比較，參地顆粒組和纈沙坦組大鼠的24hUpro顯著降低（P＜0.05）；且參地顆粒組大鼠的24hUpro變化顯著優(yōu)于纈沙坦組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠24hUpro比較（ ±s）

表1 各組大鼠24hUpro比較（ ±s）

注：模型組與正常組比較：*P＜0.05；各治療組與模型組比較：▲P＜0.05；參地顆粒組與纈沙坦組比較：△P＜0.05。

組 別 例數(shù) 24hUpro/mg·24h-1正常組 8 5.62±1.55模型組 6 33.54±4.85*參地顆粒組 7 22.65±6.20▲△纈沙坦組 6 26.38±5.03▲

2 各組大鼠腎臟中GRP78、CHOP、Nephrin、Podocalyxin蛋白表達(dá)比較

與正常組比較，模型組大鼠腎組織中的GRP78、CHOP、Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著增加，而Nephrin、Podocalyxin蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著減少（P＜0.05）。與模型組比較，參地顆粒組和纈沙坦組大鼠腎組織中的GRP78、CHOP表達(dá)量均顯著減少，而Nephrin和Podocalyxin表達(dá)量則顯著升高（P＜0.05）；且參地顆粒組GRP78、CHOP、Podocalyxin的表達(dá)變化均顯著優(yōu)于纈沙坦組（P＜0.05）。見圖1，表2。

圖1 各組大鼠腎臟GRP78、CHOP、Nephrin、Podocalyxin、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1蛋白表達(dá)比較

表2 各組大鼠腎臟GRP78、CHOP、Nephrin、Podocalyxin相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表2 各組大鼠腎臟GRP78、CHOP、Nephrin、Podocalyxin相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：模型組與正常組比較：*P＜0.05；各治療組與模型組比較：▲P＜0.05；參地顆粒組與纈沙坦組比較：△P＜0.05。

組別 例數(shù) GRP78 CHOP Nephrin Podocalyxin正常組 8 0.45±0.03 0.41±0.02 0.63±0.05 0.68±0.02模型組 6 0.90±0.04* 0.92±0.07* 0.29±0.04* 0.27±0.03*參地顆粒組 7 0.66±0.03▲△ 0.61±0.03▲△ 0.44±0.02▲ 0.55±0.03▲△纈沙坦組 6 0.78±0.01▲ 0.74±0.03▲ 0.40±0.03▲ 0.39±0.04▲

討 論

MN的發(fā)病主要是由于抗原-抗體免疫復(fù)合物沉積在腎小球毛細(xì)血管袢，導(dǎo)致基底膜彌漫性增厚。但是近年來研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞病變也參與到MN的核心發(fā)病機(jī)制中[8]。由于足細(xì)胞缺乏再生能力，因此足細(xì)胞的損傷是導(dǎo)致腎小球疾病進(jìn)展直至走向ESRD的主要原因。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的細(xì)胞器，在缺血、缺氧、氧化應(yīng)激等應(yīng)激狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境被破壞，從而導(dǎo)致未折疊蛋白的積累，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）[9]。足細(xì)胞含有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)，ERS是MN重要的發(fā)生機(jī)制之一，適度的 ERS 是細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界刺激的保護(hù)機(jī)制，但發(fā)生在腎組織內(nèi)持續(xù)或過強(qiáng)的應(yīng)激反應(yīng)是誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的機(jī)制之一[10]。足細(xì)胞損傷后導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障受損，進(jìn)而導(dǎo)致持續(xù)蛋白尿的生成。GRP78、CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵因子，GRP78是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白，參與蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的糖基化修飾，在發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)明顯增多，故可作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白[11]，其表達(dá)水平反映了細(xì)胞應(yīng)激的嚴(yán)重程度。CHOP 是 ERS信號(hào)通路下游重要的促凋亡因子，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞損傷中具有重要作用，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)多種細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)亡的關(guān)鍵信號(hào)分子[12]。ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路在嚴(yán)重ERS時(shí)都可以增加CHOP基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，作為MN的經(jīng)典動(dòng)物模型，C-BSA大鼠腎組織中GRP78、CHOP表達(dá)上調(diào)，而足細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nephrin、Podocalyxin表達(dá)減少，提示C-BSA大鼠出現(xiàn)ERS反應(yīng)增強(qiáng)及足細(xì)胞損傷。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)免疫功能、減少免疫抑制劑所帶來的代謝紊亂和免疫力下降等方面有獨(dú)特的作用。膜性腎?。∕N）是慢性腎炎的主要病理類型，其基本病機(jī)是脾腎虧虛、精微下注[13]。參地顆粒是根據(jù)清朝新安醫(yī)學(xué)名家程林所著《圣濟(jì)總錄纂要·卷十三·虛勞門》中的人參湯化裁而成，功效為健脾益腎、固攝精微，前期研究顯示該方能夠通過降低炎癥因子釋放和抑制炎癥反應(yīng)，具有改善慢性腎炎患者的臨床癥狀，減輕蛋白尿等作用[14]。且近期研究已證實(shí)其對(duì)慢性腎炎患者和模型大鼠的免疫功能紊亂具有一定調(diào)節(jié)作用[15]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，中藥參地顆粒具有減輕C-BSA大鼠的足細(xì)胞損傷及蛋白尿作用；并且能夠抑制過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)性作用。但是對(duì)于ERS在足細(xì)胞損傷中的具體機(jī)制過程，以及參地顆粒對(duì)上述機(jī)制的干預(yù)靶點(diǎn)等有關(guān)研究，仍有待于我們進(jìn)一步深入探討。