沉默CENP-N基因表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的影響*

張玉揚(yáng), 趙津平, 張丹, 翟振華△

錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1腫瘤科，2腫瘤血管與微環(huán)境實(shí)驗(yàn)室(遼寧錦州 121000)；3遼寧省健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)撫礦總醫(yī)院婦科(遼寧撫順 113008)

胃癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一，早期發(fā)病隱匿，缺乏有效診斷指標(biāo)，大多患者確診時(shí)往往已是中晚期，已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移癥狀，具有高死亡率且預(yù)后差等特點(diǎn)[1-2]。目前，臨床主要采用手術(shù)、放化療等手段治療胃癌且取得了一定進(jìn)展，但患者5年生存率仍無明顯提高[3]。因此，進(jìn)一步深入探索胃癌發(fā)病相關(guān)機(jī)制，探索有效治療靶點(diǎn)對(duì)于提高胃癌治療效果改善患者預(yù)后有重要意義。著絲粒蛋白(centromere protein，CENP)是有絲分裂階段染色體分離的主要成分，其中CENP-N是CENP的主要成員之一，可以募集其他CENPs及著絲粒，進(jìn)一步與微管之間形成鏈接，促進(jìn)細(xì)胞分裂[3-4]。Zhai等[5]研究顯示，CENP-N在乳腺癌組織中異常高表達(dá)，參與腫瘤進(jìn)展。孟慶彬等[6]研究顯示，CENP-H在胃癌組織中異常高表達(dá)且與腫瘤浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。目前有關(guān)CENP-N在胃癌中的相關(guān)研究鮮有報(bào)道，因此本研究主要探討CENP-N對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡等的影響，并分析相關(guān)機(jī)制，以期為尋找胃癌新型有效治療靶標(biāo)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 在2017年7月至2019年7月期間，從本院收集了143例胃癌患者癌組織及其癌旁組織，并將組織樣本保存在-80℃冰箱中。研究得到了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(20170406)，所有患者均簽署了書面知情同意書。人胃癌細(xì)胞系HS-746T(貨號(hào)：YS354C)及人胃黏膜細(xì)胞GES1(貨號(hào)：CL1317)人胃癌細(xì)胞株SNU-1(bio-73415)、HS-746T(YS354C)、AGS(FS-0173)、MGC-803(ml-cs-0276)及人胃黏膜細(xì)胞GES1(CL1317)均購自北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司。

RPMI-1640培養(yǎng)基(CDLG-3719)購自武漢純度生物科技有限公司；CCK-8試劑盒(CA1210-500T)、AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒(HUDY03)均購自上海碧云天公司；Hoechst33342熒光染料(B8040)購自北京索萊寶科技有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(L2000-015)購自杭州沃森生物技術(shù)有限公司；CENP-N-siRNA及無關(guān)序列siRNA-NC由上海吉瑪生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成；BCA試劑盒(批號(hào)2763DB)、蛋白提取試劑盒(BC3710-100T)購自上海吉至生化科技有限公司；兔抗CENP-N(D285-3)、細(xì)胞增殖相關(guān)核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)(100130-MM21)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)(FNab00839)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)(2774)、磷脂肌醇3-激酶(phosphati-dylinositol 3-kinase，PI3K)(PL0402037)、p-PI3K(3154-100)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)(ATA24502)、p-AKT(F48643-0.4ML)、p-mTOR(IC194464)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)(ATA33361)、p-mTOR(IC194464)、β-actin(ATA40114)、山羊抗兔HRP(SE12-0.1)二抗均購自北京索萊寶科技有限公司。

CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)CCL-050A-8)購自日本Esco公司；Elx800酶標(biāo)儀(型號(hào)HSG9832)購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息數(shù)據(jù)庫分析 利用基因表達(dá)譜交互式分析網(wǎng)站(GEPIA，http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html)中的癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)分析CENP-N基因在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平，其中胃癌組織503例，癌旁組織125例。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取SNU-1、HS-746T、AGS、MGC-803、GES1細(xì)胞解凍、復(fù)蘇，于含10%滅活胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)+RPMI-1640培養(yǎng)液、37℃、5% CO2、95% O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d左右更換1次培養(yǎng)液，無菌操作，待細(xì)胞穩(wěn)定傳代后，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞分組及處理 取1.2.2對(duì)數(shù)生長期的SNU-1細(xì)胞接種于24孔板(2.5×104個(gè)/孔)。采用LipofectamineTM2000對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，先用無血清培養(yǎng)液將LipofectamineTM2000稀釋并配制siRNA-NC、CENP-N-siRNA(均為10 mmol/L)，后將等體積LipofectamineTM2000分別與siRNA-NC、CENP-N-siRNA混勻、靜置，分別加入SW620細(xì)胞中，作為siRNA-NC組(陰性對(duì)照組)、CENP-N-siRNA組(沉默CENP-N表達(dá)組)；同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的空白對(duì)照組，以及轉(zhuǎn)染CENP-N-siRNA后，加入含PI3K通路激活劑740Y-P(100 μg/mL)[7]的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞的通路激活劑組。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)CENP-N mRNA表達(dá)水平 按照試劑盒說明書提取各組SNU-1細(xì)胞中總RNA并測(cè)定濃度及純度；以RNA為模板行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所得cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。體系20 μL：ULtraSYBR mixture(10 μL)、模板cDNA(2.0 μL)、上下游引物(各2.0 μL)、去離子純化水(4.0 μL)；條件(40個(gè)循環(huán))：93℃ 30 s、93℃ 5 s、65℃ 30 s。引物序列見表1，由赫澎(上海)生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，以β-actin為內(nèi)參，以2-ΔΔCt法計(jì)算CENP-N mRNA含量。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 取1.2.3各組培養(yǎng)48 h的SNU-1細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，接種至24孔板(2.5×104個(gè)/孔)，嚴(yán)格按照CCK-8試劑試劑盒說明書分別于培養(yǎng)48 h后加入CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，檢測(cè)490 nm處各孔細(xì)胞光密度(optic density，OD)值，重復(fù)3次，取平均值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.6 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組SNU-1細(xì)胞克隆形成率 取1.2.3各組培養(yǎng)48 h后的SNU-1細(xì)胞，消化并接種于6孔板(300個(gè)細(xì)胞/孔)，每組6個(gè)復(fù)孔，于37℃、5% CO2、95% O2條件下培養(yǎng)15 d，加入4%多聚甲醛固定30 min，0.25%結(jié)晶紫染色30 min；棄掉染液，晾干，拍照并計(jì)算克隆形成率。克隆形成率(%)=克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

分組:分別噴1.0、0.6、0.3 mL 3個(gè)劑量復(fù)合溶葡萄球菌酶溶液試驗(yàn)組、消毒劑對(duì)照組和空白對(duì)照組,消毒劑對(duì)照組選用苯扎溴銨溶液(1∶600 稀釋)。

1.2.7 Hoechst33342染色法檢測(cè)各組SNU-1細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化 取1.2.3各組培養(yǎng)48 h的SNU-1細(xì)胞，消化并接種于6孔板(1×106個(gè)/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入4%多聚甲醛(pH=7.5)，37℃固定30 min，PBS沖洗、晾干，加入Hoechst33342染液(5 mg/mL)，染色30 min，PBS沖洗、封片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組SNU-1細(xì)胞凋亡率 取1.2.3各組培養(yǎng)48 h的SNU-1細(xì)胞接種于24孔板(2.5×105個(gè)/孔)，參照Annexin-V FITC/PI試劑盒說明書，以5 μL PI+5 μL AnnexinV-FITC雙染試劑4℃避光進(jìn)行染色30 min，稀釋；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.9 免疫印跡法檢測(cè)增殖、凋亡及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 取1.2.3各組培養(yǎng)48 h的SNU-1細(xì)胞，以RIPA裂解并提取總蛋白，檢測(cè)濃度及純度，行12%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，放入脫脂奶粉(5%)溶液室溫封閉2 h，分別加入一抗增殖相關(guān)蛋白(PCNA)、凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax)、PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白和CENP-N蛋白(p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、CENP-N)、內(nèi)參β-actin，均為1∶500的稀釋比，4℃過夜，加入HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，顯影、定影，半定量分析各蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1 生物信息數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果 利用GEPIA網(wǎng)站得到CENP-N mRNA在503例胃癌組織和125例癌旁組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，CENP-N在胃癌組織、癌旁組織中的表達(dá)分別為4.25±0.36、1.45±0.21，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 CENP-N在胃癌組織中的表達(dá)水平 與癌旁組織比較，胃癌組織中CENP-N mRNA及蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖1和表2。

圖1 Western blot檢測(cè)胃癌組織中CENP-N蛋白表達(dá)水平

表2 在胃癌組織中CENP-N mRNA及蛋白的表達(dá)水平

2.3 CENP-N在不同胃癌系中的表達(dá) 與GES1細(xì)胞比較，CENP-N mRNA在胃癌SNU-1、HS-746T、AGS、MGC-803細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，且CENP-N mRNA在SNU-1細(xì)胞中的表達(dá)水平最高。因此，選擇SNU-1細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究，見表3。

表3 CENP-N在不同胃癌系中的mRNA表達(dá)水平

圖2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果(×100)

表4 CENP-N mRNA水平比較

2.5 各組SNU-1細(xì)胞增殖情況比較 與空白對(duì)照組、siRNA-NC組比較，CENP-N-siRNA組SNU-1細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)；與CENP-N-siRNA組比較，通路激活劑組SNU-1細(xì)胞增殖抑制率顯著降低(P<0.05)。見表5。

表5 各組細(xì)胞增殖情況比較

2.6 各組SNU-1細(xì)胞平板克隆結(jié)果比較 與空白對(duì)照組、siRNA-NC組比較，CENP-N-siRNA組SNU-1細(xì)胞克隆形成率顯著降低(P<0.05)；與CENP-N-siRNA組比較，通路激活劑組SNU-1細(xì)胞克隆形成率顯著升高(P<0.05)。見圖3及表6。

圖3 各組SNU-1細(xì)胞平板克隆結(jié)果比較

表6 各組SNU-1細(xì)胞平板克隆結(jié)果比較

2.7 各組SNU-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 Hoechst33342染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、siRNA-NC組SNU-1細(xì)胞呈圓形或橢圓形，核完整、形態(tài)飽滿，邊緣清晰，染色呈均勻彌漫的淺色熒光，未見亮藍(lán)色細(xì)胞核；CENP-N-siRNA組SNU-1細(xì)胞細(xì)胞數(shù)減少，核皺縮破裂，胞核或胞質(zhì)內(nèi)有濃縮致密的藍(lán)色熒光，呈細(xì)胞凋亡形態(tài)，當(dāng)加入通路激活劑后，細(xì)胞此種形態(tài)變化有明顯改善。見圖4。

圖4 各組SNU-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(×400)

2.8 各組SNU-1細(xì)胞凋亡情況比較 與空白對(duì)照組、siRNA-NC組比較，CENP-N-siRNA組SNU-1細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與CENP-N-siRNA組比較，通路激活劑組SNU-1細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖5及表7。

表7 各組SNU-1細(xì)胞凋亡情況比較

圖5 各組SNU-1細(xì)胞凋亡情況比較

2.9 各組SNU-1細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與空白對(duì)照組、siRNA-NC組比較，CENP-N-siRNA組SNU-1細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA、抑凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)顯著降低(P<0.05)，促凋亡相關(guān)蛋白Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與CENP-N-siRNA組比較，通路激活劑組SNU-1細(xì)胞PCNA、Bcl-2表達(dá)顯著升高(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖6及表8。

表8 各組細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

圖6 各組細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.10 各組SNU-1細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與空白對(duì)照組、siRNA-NC組比較，CENP-N-siRNA組SNU-1細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與CENP-N-siRNA組比較，通路激活劑組SNU-1細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見圖7及表9。

圖7 各組SNU-1細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

表9 各組SNU-1細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3 討論

胃癌是胃黏膜上皮細(xì)胞惡性腫瘤，發(fā)病早期癥狀不典型，大多患者于中晚期才得以確診，隨著醫(yī)療水平的不斷提高，胃癌診療方法也得到有效提升，主要包括手術(shù)輔以放化療或聯(lián)合治療等，但是患者5年生存率仍居于30%左右[8]。因此深入探索胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)機(jī)制，尋找新型生物學(xué)靶標(biāo)以提高胃癌治療效果具有重要的意義。

CENP-N是線粒體蛋白，不僅能夠募集其他CENPs及著絲粒，與有絲分裂紡錘體微管之間形成鏈接，推動(dòng)染色體分離，還能夠識(shí)別著絲粒核小體中的著絲粒特異性組蛋白CENP-A，實(shí)現(xiàn)線粒體和著絲粒染色質(zhì)正確組裝，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分裂及增殖[9-10]。在CENP中，CENP-A高表達(dá)的乳腺癌患者預(yù)后更差，整體生存期更短[11]；CENP-A mRNA和蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，其表達(dá)與腫瘤體積大小、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)[12]。而關(guān)于CENP-N在腫瘤中的研究較少，僅僅有研究報(bào)道CENP-N在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中異常高表達(dá)，且下調(diào)其表達(dá)后可明顯阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展并抑制細(xì)胞增殖[13]。本研究利用GEPIA網(wǎng)站中的TCGA數(shù)據(jù)以及收集的143例胃癌患者癌組織及其癌旁組織，發(fā)現(xiàn)CENP-N mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織；還發(fā)現(xiàn)CENP-N mRNA在SNU-1、HS-746T、AGS、MGC-803胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于人胃黏膜細(xì)胞GES1，且CENP-N mRNA在SNU-1細(xì)胞中的表達(dá)水平最高，因此，以胃癌SNU-1細(xì)胞為研究對(duì)象，探究CENP-N對(duì)SNU-1細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并分析相關(guān)機(jī)制。本研究利用倒置熒光顯微鏡可觀察到CENP-N-siRNA組細(xì)胞有較強(qiáng)綠色熒光，且CENP-N-siRNA組SNU-1細(xì)胞CENP-N mRNA水平顯著低于空白對(duì)照組及siRNA-NC組，說明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡失衡是腫瘤進(jìn)展最主要的因素，其中PCNA是細(xì)胞增殖核抗原，能夠識(shí)別細(xì)胞周期，反應(yīng)細(xì)胞增殖活性；Bax、Bcl-2是最主要的凋亡相關(guān)蛋白，分別具有促凋亡、抑凋亡作用[14]。Hoechst33342可透過細(xì)胞膜，與DNA結(jié)合而發(fā)出藍(lán)色熒光，用以檢測(cè)細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示，抑制CENP-N表達(dá)后，SNU-1細(xì)胞呈明顯的細(xì)胞凋亡形態(tài)，且增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著升高，PCNA、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低。提示抑制CENP-N表達(dá)可抑制胃癌SNU-1細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，其異?；罨c宮頸癌[16]、胃癌[17]等腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。其中PI3K是通路的起始因子，其活化后產(chǎn)生第二信使PIP3，進(jìn)一步磷酸化下游Akt蛋白的Thr308位點(diǎn)，促使Akt活化，而活化的Akt磷酸化并激活下游靶基因mTOR并促使mTOR發(fā)生磷酸化反應(yīng)，調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長，抑制細(xì)胞凋亡[18-19]。既往研究顯示，過表達(dá)C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族5成員A可通過活化PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖[20]；FGFC1可以抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖活性，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，該機(jī)制與抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路活化有關(guān)[21]。本研究結(jié)果顯示，抑制CENP-N表達(dá)后，SNU-1細(xì)胞p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)顯著降低。當(dāng)在轉(zhuǎn)染CENP-N-siRNA基礎(chǔ)上加入通路激活劑后，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)、細(xì)胞凋亡能力減弱。提示沉默CENP-N表達(dá)可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路活化抑制SNU-1細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，沉默CENP-N表達(dá)可抑制胃癌SNU-1細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，該機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路活化有關(guān)，可能是胃癌新型生物治療的靶標(biāo)。但本研究未能明確PI3K/AKT/mTOR通路在SNU-1細(xì)胞增殖、凋亡中的具體作用機(jī)制，后期仍需進(jìn)一步研究。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：翟振華：主持研究，質(zhì)量控制；張玉揚(yáng)：課題設(shè)計(jì)、文獻(xiàn)檢索、論文撰寫；趙津平：實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、實(shí)驗(yàn)試劑、細(xì)胞等準(zhǔn)備；張丹：文獻(xiàn)檢索、論文撰寫。