小鼠睪丸體外生精小管模型構建及Rho/ROCK信號通路對其重構的影響

孫夢迪，李春陽，劉松坡，李小明，徐 睿，蘭東鋒，代小方，張繼東

(1.遵義醫(yī)科大學 免疫學教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學 遺傳學教研室，貴州 遵義 563099)

隨著工業(yè)社會的發(fā)展，不孕不育已經(jīng)成為全民健康問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計,婚后1年患有不孕不育的夫婦占8%～12%，其中單由男方因素所致的不育占50%[1]。除男性生殖系統(tǒng)本身異常導致精子發(fā)生障礙之外，社會和環(huán)境因素同樣會造成男性不育[2-3]。因此明確男性不育的病因及發(fā)病機制對臨床治療男性不育具有重要意義。睪丸作為精子發(fā)生的重要場所，明確其發(fā)育過程能更好的幫助我們尋找精子發(fā)生異常的原因，從而解決男性不育。然而，機體睪丸發(fā)育及精子發(fā)生過程非常復雜，給相關研究帶來一定困難。近年來，類器官、睪丸體外研究模型的建立為明確生精小管形成和精子發(fā)生機制提供了諸多可能[4]。此外，我們前期研究中通過添加KSR在體外成功重構出生精小管樣結構[5]。支持細胞作為生精小管的主要細胞在1865年被意大利生物學家Enrico Sertoli首次報道。隨后對原代支持細胞的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其在維持生殖細胞存活及精子發(fā)生過程中扮演至關重要的角色[6]。因此，支持細胞體外培養(yǎng)可作為研究睪丸形成和精子發(fā)生的理想模型。

研究證實生精小管發(fā)育和精子發(fā)生受到激素、蛋白、生長因子以及信號通路等因素的相互調(diào)控[7-9]。TGFβ信號通路相關分子可參與調(diào)控胚胎期睪丸的形成及生殖細胞的增殖及分化[10]。我們前期研究結果發(fā)現(xiàn)TGF-β-ALK5信號軸參與體外睪丸生精小管重構，促進CD34+內(nèi)皮細胞、p75+細胞、管周肌樣細胞(Peritubular myoid cells，PTMs)和SCs的增殖及SCs和其他睪丸細胞的遷移[11]。DHH/PTCH1信號軸通過上調(diào)PTCH1+細胞中類固醇生長因子1(Steroidogenic Factor 1，SF1)的表達促進胚胎睪丸間質(zhì)細胞的分化[12]以及Notch可通過下調(diào)支持細胞膠質(zhì)源性神經(jīng)生長因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF )的表達來調(diào)節(jié)生精細胞的增殖和分化狀態(tài)，從而維持精原干細胞穩(wěn)態(tài)等[13]。即便如此，參與生精小管形成及精子發(fā)生過程中的大量調(diào)控因子及其機制仍有待進一步明確。Rho/ROCK信號通路廣泛存在于生物體內(nèi)，發(fā)揮促進細胞增殖、遷移、細胞骨架重塑等作用[14]。在胚胎發(fā)育早期用Y27632抑制ROCK后，小鼠心臟、神經(jīng)、軀體等出現(xiàn)明顯發(fā)育缺陷，表明Rho/ROCK信號通路還可參與器官發(fā)育[15]。在睪丸組織中，與生殖細胞相比，RhoA、Rac1在支持細胞呈高表達[16]。Limanjaya等[17]報道L-選擇素通過L-型Ca2+通道誘導Ca2+流入支持細胞內(nèi)活化RhoA、Rac1蛋白，從而調(diào)節(jié)細胞骨架和支持細胞間的緊密連接。在對生殖系統(tǒng)相關毒性研究中發(fā)現(xiàn)，雷公藤通過抑制支持細胞中Rho、ROCK蛋白的表達破壞支持細胞與生殖細胞間的緊密連接[18]。但Rho/ROCK信號通路在睪丸形成過程中的具體作用機制亟需進一步探討。本研究旨在建立體外生精小管培養(yǎng)模型，探討Rho/ROCK信號通路在調(diào)控生精小管形成中的作用，為男性不育癥的發(fā)病機制研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 水平搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；體視顯微鏡(南通晶銳光學電子有限公司)；3111型二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；IX53倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；DM2500熒光顯微鏡(德國Leica公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基、FBS、KSR(美國Gbico公司)；IV型膠原蛋白酶(美國Worthington公司)；透明質(zhì)酸酶(德國Merck公司)；I型膠原蛋白(日本新田明膠株式會社)；4%多聚甲醛、Percoll細胞分離液、青鏈霉素混合液、24孔板爬片(北京索萊寶科技有限公司)；SOX-9多克隆抗體、DAPI(德國Merck公司)；Alexa FluorTM594 donkey anti-mouse(美國Thermo-Invitrogen公司)； Y27632、BK(美國MCE公司)；六孔板(廣州海貍生物科技有限公司)。

1.2 實驗動物 10日齡雄性C57/BL6小鼠由遵義醫(yī)科大學實驗動物中心提供，《實驗動物生產(chǎn)許可證》許可證號為SYXK(黔)2021- 0002，按照遵義醫(yī)科大學實驗動物飼養(yǎng)管理條例，并經(jīng)過遵義醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審批，倫審[2019]2-089，飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級實驗室，人工控溫23℃， 12 h光照，12 h黑暗，自由飲水采食。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組 RPMI 1640培養(yǎng)基作為對照組(cont組)、KSR組、FBS組、KSR+Y27632組 (5μM Y27632、10 μM Y27632、25 μM Y27632)及Bradykinin(BK)組,各組DMSO終濃度均為0.1%。

1.3.2 小鼠睪丸支持細胞分離及培養(yǎng) 取新生10日齡小鼠睪丸，去除白膜后，0.1% 膠原蛋白酶酶解消化30 min，靜置后去除包含有睪丸間質(zhì)細胞的上清，將剩余組織剪至約3 mm小塊后加入膠原蛋白酶和透明質(zhì)酸酶再次酶解消化1 h后吹打均勻，200目細胞尼龍網(wǎng)過濾得到單細胞懸液，將3 mL單細胞懸液以1∶1比例緩慢加入3 mL 30% Percoll細胞分離液上方，230 g離心10 min，吸取分層處細胞即為粗提支持細胞。將分離得到的支持細胞分為cont組、KSR組、FBS組、KSR+Y27632組、BK組均勻鋪于10%膠原蛋白上，放置在 37℃，含5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)6 d，前3 d每天換液去除生殖細胞。

1.3.3 免疫熒光鑒定支持細胞純度 將分離得到的支持細胞接種于24孔板爬片上，待其完全貼壁去除生殖細胞(約3 d)后取出爬片用4%多聚甲醛固定。參照參考文獻[19]方法進行免疫熒光染色。一抗稀釋濃度GATA4 1∶200，二抗稀釋濃度 1：200，Alexa FluorTM594 donkey anti-mouse 陽性為紅色；DAPI終濃度為5 μg/mL。利用Image J軟件對GATA4+DAPI+細胞數(shù)量進行計數(shù)。

1.3.4 生精小管形態(tài)觀察 相差顯微鏡下連續(xù)每天監(jiān)測各組支持細胞形態(tài)變化及生精小管形成情況。

2 結果

2.1 分離支持細胞的鑒定 GATA4是支持細胞標志物，如圖1所示，GATA4+DAPI+支持細胞達90%以上，表明支持細胞粗分離成功。

A:分離提取10日齡小鼠睪丸支持細胞，GATA4(紅色)標記支持細胞;B:DAPI(藍色)標記細胞核;C:利用IF技術對細胞純度進行鑒定；×10。圖1 分離細胞中GATA4+ 細胞支持細胞的鑒定

2.2 原代SCs生精小管體外2D模型的構建 將分離得到的細胞分為cont組、FBS組、KSR組，如圖2所示，可以觀察到在cont組中細細胞伸長呈梭形并具有方向性，朝向管腔，細胞與細胞之間相互連接呈管狀分布，但FBS組細胞僅僅變?yōu)殚L梭形，未有管狀結構形成。以上結果說明生精小管2D培養(yǎng)模型構建成功。

2.3 Rho/ROCK信號通路在生精小管形成過程中的作用 將分離得到的細胞分為cont組、KSR組、KSR+Y組。觀察到 KSR組有明顯管狀結構形成，而添加ROCK分子抑制劑后，隨著抑制劑Y27632濃度的升高，管狀結構逐漸崩解(見圖3)。

A、B：培養(yǎng)6 d時cont組和KSR組細胞形態(tài)；C、D、E：培養(yǎng)6 d后不同抑制劑濃度對生精小管樣結構重構的影響；黑色箭頭指向被破壞的生精小管樣結構；×10。圖3 抑制劑Y27632對生精小管樣結構重構的作用

為了進一步明確管狀結構的形成是否與Rho/ROCK信號通路相關，選用Rho蛋白激動劑BK進一步驗證，結果發(fā)現(xiàn)BK組細胞相較于對照組呈長梭形，并且細胞與細胞之間相互連接，呈現(xiàn)出類似于KSR組的管狀結構(見圖4)。以上結果表明，在生精小管形成過程中，Rho/ROCK信號通路扮演著重要的角色。

A、B、C：培養(yǎng)6 d時cont組、KSR組、BK組細胞形態(tài)；黑色箭頭代表生精小管樣結構；×10。圖4 激動劑BK對生精小管樣結構重構的作用

3 討論

支持細胞是雄性睪丸生精上皮的主要細胞，與睪丸間質(zhì)細胞和管周肌樣細胞共同構成生精微環(huán)境維持精子發(fā)生。胚胎期生殖腺支持細胞數(shù)量的維持對啟動生精小管形成具有重要意義[20]。而在成年期，其作為“Nurse”細胞通過形成緊密連接、黏附連接等維持生殖細胞分化發(fā)育為精細胞[6]。有研究表明支持細胞是睪丸中一類重要的毒性作用靶細胞[21]。支持細胞體外重構生精小管系統(tǒng)不僅為研究生精小管形成機制、體外重現(xiàn)精子發(fā)育過程提供一個很好的模型，還可成為研究生殖毒性的一種可靠模型。因此，在本研究中，將支持細胞分離，在體外構建生精小管模型并探討能夠影響生精小管形成的因素。首先對分離出的細胞進行鑒定，免疫熒光結果顯示，分離所得的細胞中GATA4+DAPI+細胞占90%以上，說明支持細胞分離成功。據(jù)Hadley等[22]報道，在添加卵泡刺激素、表皮生長因子、胰島素等生長因子培養(yǎng)支持細胞時，將支持細胞鋪在人工合成基底膜(包含層粘連蛋白、IV型膠原蛋白、巢蛋白等)上與普通培養(yǎng)相比，前者可維持支持細胞逐漸伸長呈柱狀形成索狀結構并伴隨著雄激素結合蛋白和轉鐵蛋白的分泌。但是以上培養(yǎng)系統(tǒng)所含營養(yǎng)成分眾多，不利于深入研究參與生精小管形成的影響因素。2017年，Zhang等[23]將分離得到的支持細胞置于基質(zhì)膠上，在添加KSR后同樣在體外重構出管狀結構。但基質(zhì)膠中同樣含有大量生長因子。為了避免多種營養(yǎng)物質(zhì)的干擾，采用無營養(yǎng)成分的I型膠原蛋白作為支架，結果發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的增加，對照組細胞由最初的圓形貼壁變?yōu)椴灰?guī)則形，細胞數(shù)量并沒有隨著培養(yǎng)時間的延長而增加。FBS組只觀察到細胞貼壁后逐漸伸長呈纖維狀，細胞大量增殖，無管狀結構形成。有意思的是在添加KSR后，鏡下觀察到隨著培養(yǎng)時間的增加細胞逐漸伸長、聚集，隨后細胞與細胞相連、遷移并逐漸形成管狀結構。以上結果提示生精小管模型構建成功，故我們推斷KSR中含有某些未知成分能夠促進生精小管形成。

Rho GTP酶(Rho GTPases)是1985年發(fā)現(xiàn)的Ras超家族中的一員，其主要成員有Rho，Rac和Cdc42三類，具有調(diào)節(jié)細胞遷移、細胞增殖以及細胞極性等功能。ROCK又稱Rho相關蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil kinase,ROCK)，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是目前功能研究最為詳細的Rho下游效應分子。ROCK有兩種異構體ROCK1和ROCK2，其中ROCK1在非神經(jīng)組織(肝，肺，脾和睪丸)中廣泛表達，而ROCK2主要分布在腦，心臟和肌肉中。Rho GTP酶活化后激活下游分子ROCK，進而磷酸化ROCK下游底物肌球蛋白輕鏈(Myosin light chain,MLC)、LIM激酶(LIM kinase，LIMK)、埃茲蛋白/根連蛋白/膜突蛋白(Ezrin/Radixin/Moesin,ERM)等通過調(diào)節(jié)細胞肌動蛋白骨架的重組調(diào)節(jié)細胞遷移、吞噬、收縮和粘附等作用[14]，體外研究發(fā)現(xiàn)ROCK分子抑制劑Y27632可抑制胚胎期小鼠心臟、神經(jīng)、軀體[15]、腎臟輸尿管[24]的形成。為了進一步明確Rho/ROCK信號通路在生精小管重構過程中的作用，我們選用ROCK分子抑制劑Y-27632及Rho蛋白激動劑BK探討Rho/ROCK信號通路的作用，結果發(fā)現(xiàn)與KSR組相比，隨著抑制劑濃度的增加，生精小管結構逐漸崩解，細胞由長梭形逐漸趨向于圓形。相反的是在添加BK后，細胞伸長、遷移并相互連接形成類似于KSR組的管狀結構。以上研究表明Rho/ROCK信號通路在SCs參與的生精小管形成過程中具有重要作用。有研究報道，在Rac1、Cdc42敲除小鼠中睪丸重量下降，血睪屏障破壞，SCs極性消失，生殖細胞發(fā)育受阻，睪丸生精小管排列紊亂[25-26]。RhoB在睪丸SCs、間質(zhì)細胞及早期生殖細胞中表達，調(diào)節(jié)黏附連接的動態(tài)平衡[27]。Lui等[28]研究發(fā)現(xiàn)整合素可激活RhoB，活化ROCK/LIMK/Cofilin通路介導黏附連接解聚，促進生殖細胞進入近腔面參與生精過程。與RhoB GTPase介導的黏附連接調(diào)節(jié)機制不同，Cdc42通過與其效應物如IQGAP1的相互作用參與調(diào)節(jié)E-鈣粘附素介導的支持細胞生殖細胞細胞間粘附，失活的Cdc42可擾亂細胞黏附功能[29]。這些研究提示Rho蛋白參與睪丸生精小管的形成。

睪丸生精小管形成過程涉及因素眾多，雖然體外模型研究日漸發(fā)展迅速，迄今為止，相關研究仍有眾多問題亟待解決，包括如何確保體外研究模型的真實客觀性；調(diào)節(jié)生精小管形成的基因、信號通路之間究竟如何聯(lián)系等。綜上所述，本研究成功構建了生精小管體外培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)Rho/ROCK信號通路參與生精小管重構過程。但Rho和ROCK在體內(nèi)分布廣泛，涉及的生理病理功能復雜，與其他信號通路的相互作用尚未明確，在今后的研究中仍需進一步深入探索Rho/ROCK信號通路在生精小管重構中的作用。