脂肪酸結(jié)合蛋白4在卵泡液局部的作用及其機(jī)制探討

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，山東 青島 266003)

脂肪酸結(jié)合蛋白4(FABP4)是一種小分子脂質(zhì)結(jié)合蛋白，主要在脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中表達(dá)并分泌[1-2]；其功能是可逆地結(jié)合脂質(zhì)并將其運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中特定的細(xì)胞器，如線粒體、過(guò)氧化物酶體、細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[3]，進(jìn)而參與調(diào)控脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、自身免疫反應(yīng)和氧化應(yīng)激過(guò)程[4-6]。卵泡液在卵泡發(fā)育至成熟竇卵泡的過(guò)程中逐漸積聚，由免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、活性氧、脂質(zhì)、激素等多種物質(zhì)組成[7]。目前研究認(rèn)為，卵泡液中炎癥因子以及活性氧自由基(ROS)參與不同階段的卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟過(guò)程[7-9]。FABP4作為炎癥、氧化應(yīng)激和脂代謝共同遞質(zhì)，目前在女性生殖領(lǐng)域的研究主要集中在胚胎著床過(guò)程，而FABP4是否參與卵泡液局部炎癥反應(yīng)及脂質(zhì)代謝過(guò)程，尚缺乏相關(guān)臨床證據(jù)。因此本研究旨在探討FABP4在卵泡液局部環(huán)境中主要參與的生理過(guò)程，及其對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究納入2020年6月—2021年1月在青島大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科因單純輸卵管和(或)男性因素行體外受精/卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)的女性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在月經(jīng)周期紊亂和(或)性激素測(cè)定異常；②存在甲狀腺疾病、腎上腺疾病、多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥；③有惡性腫瘤病史。根據(jù)受試者卵泡液中FABP4濃度的百分位數(shù)分為3個(gè)濃度組：A組(FABP4的濃度≤24.56 μg/L，P0～P25)，B組(24.56 μg/L48.36 μg/L，P76～P100)。

1.2 IVF/ICSI及胚胎培養(yǎng)

所有受試者均采用拮抗劑方案進(jìn)行促排卵，待雙側(cè)卵巢至少2個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡的直徑≥18 mm或者3個(gè)≥17 mm時(shí)，結(jié)合雌二醇(E2)水平確定扳機(jī)時(shí)間，當(dāng)晚肌注人絨毛膜促性腺激素(hCG)(麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司)6 000～8 000 U，36～38 h后在陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵。取卵后4～6 h，根據(jù)精液參數(shù)或既往受精情況采用常規(guī)IVF/ICSI授精。體外受精后，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.06 CO2培養(yǎng)箱中使用G-1medium培養(yǎng)胚胎，18 h后觀察受精情況，72 h后評(píng)估胚胎質(zhì)量：根據(jù)形態(tài)學(xué)參數(shù)將早期胚胎分為4級(jí)，Ⅰ、Ⅱ級(jí)胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎[10]。

1.3 觀察指標(biāo)的收集和卵泡液指標(biāo)檢測(cè)

受試者一般觀察指標(biāo)，包括年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、基礎(chǔ)E2、基礎(chǔ)孕酮(P)、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(AFC)；促排卵監(jiān)測(cè)指標(biāo)，包括促性腺激素(Gn)使用總量、hCG注射日E2、hCG注射日P；IVF實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，包括獲卵數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率；卵泡液觀察指標(biāo)，包括總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)、FABP4、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)。其中優(yōu)質(zhì)胚胎率=受精后72 h優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN胚胎總數(shù)×100%。

卵泡液收集和檢測(cè)：取卵過(guò)程中，第一穿刺卵泡選擇直徑18～22 mm者進(jìn)行穿刺，并收集第一管無(wú)血液污染的卵泡液，采用常溫離心法(1 800 r/min離心8 min)去除細(xì)胞沉淀和雜質(zhì)，留取上清液分裝后于-80 ℃低溫保存待測(cè)。采用日立化成診斷系統(tǒng)株式會(huì)社提供的LDL-C(選擇性可溶化法)、TC(酶法)和TG(去游離法和酶法)檢測(cè)試劑盒，分別檢測(cè)卵泡液中LDL-C、TC和TG的濃度，檢測(cè)儀器為貝克曼庫(kù)爾特AU5821全自動(dòng)生化分析儀(克曼庫(kù)爾特有限公司,美國(guó))，每份樣品均設(shè)復(fù)孔檢測(cè)。采用武漢伊萊瑞特生物有限公司提供的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒分別檢測(cè)卵泡液中FABP4、MCP-1、IL-6和ox-LDL的濃度，檢測(cè)儀器為TECAN SUNRISE酶標(biāo)儀(帝肯公司，瑞士)，每份樣品均設(shè)復(fù)孔檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 3組受試者基線數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)室觀察指標(biāo)比較

本研究共納入符合要求的受試者為122例，其中A組30例，B組62例，C組30例。3組受試者的基線數(shù)據(jù)，包括年齡、BMI、基礎(chǔ)性激素(E2、P)、hCG注射日性激素(E2、P)、HOMA-IR、AFC和Gn使用總量比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)；3組受試者實(shí)驗(yàn)室觀察指標(biāo)(獲卵數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎率)比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 3組受試者卵泡液中相關(guān)因子濃度的比較

A、B和C組卵泡液中MCP-1、IL-6、ox-LDL水平隨FABP4濃度增高而增高，組間比較差異有顯著性(H=11.371～54.114，P<0.01)；兩兩比較結(jié)果顯示，A組MCP-1、ox-LDL水平均顯著低于B、C組(H=-65.017～-19.447，P<0.01)；A組IL-6水平顯著低于C組(H=-30.633，P<0.01)；并且B組MCP-1、ox-LDL水平均顯著低于C組(H=-36.337、-44.331，P<0.01)；3組受試者卵泡液中LDL-C、TC和TG水平比較差異均無(wú)顯著性(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表1 3組受試者基線數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)室觀察指標(biāo)比較Tab.1 Comparison of baseline data and laboratory markers between the three groups

表2 3組受試者卵泡液各因子濃度的比較Tab.2 Comparison of the concentrations of various factors in follicular fluid between the three groups

2.3 影響優(yōu)質(zhì)胚胎率的多因素線性回歸分析

將年齡、BMI、AFC、Gn使用總量、hCG注射日E2、hCG注射日P及卵泡液中FABP4、MCP-1、IL-6、ox-LDL、LDL-C、TC、TG共13個(gè)自變量納入線性回歸模型，采用后退法篩選自變量。結(jié)果顯示，模型中剩余5個(gè)自變量，其中卵泡液中FABP4(β=-0.520，95%CI=-0.981～-0.059,P<0.05)，IL-6(β=-0.114，95%CI=-0.212～-0.015,P<0.05)，Gn使用總量(β=-0.008，95%CI=-0.016～-0.001,P<0.05)是優(yōu)質(zhì)胚胎率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而卵泡液中ox-LDL(β=0.010，95%CI=0.003～0.017,P<0.05)，BMI(β=2.122，95%CI=0.390～3.853,P<0.05)是優(yōu)質(zhì)胚胎率的獨(dú)立保護(hù)因素，5個(gè)自變量的方差膨脹因子都小于2，不存在共線性。

3 討 論

研究表明，F(xiàn)ABP4是炎癥、脂代謝和氧化應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路中共同的調(diào)節(jié)因子，在多種代謝性和炎癥性疾病中起關(guān)鍵作用[11-13]。MCP-1主要由內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞表達(dá)，參與單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞遷移和滲透[14]。IL-6主要由免疫細(xì)胞產(chǎn)生，在卵泡發(fā)育過(guò)程中影響血管通透性以及血管生成[7]。本研究表明，卵泡液中MCP-1和IL-6水平隨FABP4濃度的升高而增高，提示FABP4在卵泡液環(huán)境中參與局部炎癥過(guò)程。在巨噬細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中沉默F(xiàn)ABP4可導(dǎo)致MCP-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子顯著減少[11,15]。目前研究認(rèn)為FABP4會(huì)通過(guò)激活I(lǐng)KK-NF-κB以及JNK-AP-1通路促進(jìn)炎癥發(fā)生[16-17]。卵泡液中炎癥因子參與卵巢正常生理過(guò)程，包括排卵期的血管生成、類固醇生成、卵母細(xì)胞成熟、白細(xì)胞浸潤(rùn)以及卵泡破裂和重塑[18]。因此或許可以認(rèn)為卵泡液中FABP4可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)參與卵巢正常的生理過(guò)程，但還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

ox-LDL是LDL受ROS氧化修飾后的產(chǎn)物，當(dāng)機(jī)體發(fā)生ROS和抗氧化系統(tǒng)失衡，過(guò)多的ROS會(huì)引起脂質(zhì)過(guò)氧化，其中包括LDL，因此ox-LDL可以作為體內(nèi)氧化應(yīng)激的標(biāo)記物[19]。本研究表明，ox-LDL濃度隨FABP4的升高而增高，提示FABP4與卵泡液局部氧化應(yīng)激可能有關(guān)。既往研究表明，F(xiàn)ABP4與氧化應(yīng)激之間存在相互作用，ox-LDL可在多種細(xì)胞類型中誘導(dǎo)FABP4表達(dá)[17,20]，而在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中，沉默F(xiàn)ABP4可降低其氧化應(yīng)激水平[6,21]。此外，F(xiàn)ABP4-/-小鼠體內(nèi)由ox-LDL誘導(dǎo)產(chǎn)生的MCP-1以及TNF-α表達(dá)明顯減少[22]。因此或許可以認(rèn)為卵泡液中FABP4可能與局部氧化應(yīng)激有關(guān)系，并且ox-LDL可能是部分通過(guò)FABP4上調(diào)炎癥水平，但具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

FABP4除了是炎癥過(guò)程重要的遞質(zhì)，同時(shí)還可調(diào)控脂質(zhì)代謝過(guò)程；FABP4可逆性結(jié)合脂肪酸并完成其亞細(xì)胞器的靶向運(yùn)輸，脂肪酸隨即轉(zhuǎn)化并合成TG和TC；TG是大多數(shù)生物體重要的能量?jī)?chǔ)存形式，對(duì)卵母細(xì)胞和卵巢的發(fā)育至關(guān)重要；TC是所有類固醇激素的前體，進(jìn)一步通過(guò)酶促反應(yīng)逐步合成P、睪酮和E2等類固醇激素[8]。FAN等[8]在鵝卵巢顆粒細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)ABP4過(guò)表達(dá)的顆粒細(xì)胞中細(xì)胞色素P45011A1(CYP11A1)和細(xì)胞色素P45019A1(CYP19A1)mRNA和蛋白水平明顯增高，培養(yǎng)基中P和E2濃度明顯升高，提示FABP4促進(jìn)類固醇激素合成。臨床試驗(yàn)也表明，循環(huán)血中FABP4與雄激素水平獨(dú)立相關(guān)[13]。但本研究未觀察到基礎(chǔ)或hCG注射日雌孕激素水平以及卵泡液中TG和TC濃度在不同F(xiàn)ABP4濃度分組間的差異。此外，既往研究表明循環(huán)血液中FABP4水平的升高與BMI及胰島素抵抗增高、血脂代謝紊亂有關(guān)[23]，但本研究中也未觀察到卵泡液中FABP4與HOMA-IR、BMI的關(guān)聯(lián)性。這種卵泡液中FABP4和循環(huán)血液中FABP4的差異可能與卵泡液特殊炎癥環(huán)境有關(guān)。研究表明卵泡液中MCP-1、IL-6、IL-8、IL-10等炎癥因子水平均高于循環(huán)血液中[24]。因此，推測(cè)卵泡液中FABP4受局部炎癥環(huán)境影響更大，進(jìn)而可能掩蓋了FABP4在卵巢局部脂代謝和類固醇合成過(guò)程中的作用。

優(yōu)質(zhì)胚胎率是體現(xiàn)卵母細(xì)胞質(zhì)量的重要IVF實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，與女性生育力密切相關(guān)。生理狀態(tài)下，卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟受到炎癥因子和ROS的調(diào)控；而各種病理情況下，過(guò)度激活的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激對(duì)女性生育力產(chǎn)生負(fù)面影響，但臨床研究結(jié)果尚存在爭(zhēng)議[7,9,25]。本研究線性回歸模型表明，卵泡液中FABP4是優(yōu)質(zhì)胚胎率的危險(xiǎn)因素，且該作用獨(dú)立于卵泡液中IL-6、ox-LDL及BMI和Gn使用總量。目前FABP4對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)量影響的直接機(jī)制研究較少，根據(jù)本研究的結(jié)果可以推測(cè)，卵泡液中FABP4對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)量的不利影響可能不限于其與炎癥因子IL-6以及ox-LDL的關(guān)聯(lián)，F(xiàn)ABP4在脂代謝和炎癥反應(yīng)中作用的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，卵泡液中FABP4可能是通過(guò)與MCP-1、IL-6和ox-LDL的相互作用參與了局部的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激過(guò)程，并且進(jìn)一步影響卵母細(xì)胞質(zhì)量。此外，本研究并沒(méi)有觀察到卵泡液中FABP4與BMI、HOMA-IR和卵泡液中脂代謝指標(biāo)(TC、TG和LDL-C)存在顯著的臨床關(guān)聯(lián)，而這可能與卵泡液局部獨(dú)特的促炎環(huán)境有關(guān)。但本研究樣本量有限，結(jié)論尚需要多中心研究進(jìn)一步證實(shí)。

利益沖突聲明：所有作者、資助者、作者單位不存在與公眾/個(gè)人產(chǎn)生研究客觀性、公正性、經(jīng)濟(jì)利益等方面的利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors, sponsors and Author affiliation disclose no relevant conflicts with the public or individuals in the objectivity, fairness, or financial interest of the research.

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗(yàn)均已通過(guò)青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)(文件號(hào)QYFYWZLL26587)。受試對(duì)象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

EthicsApprovalandPatientConsent： All clinical experimental protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University(Approval Letter No. QYFYWZLL26587). Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻(xiàn)：劉建新、夏晨參與了臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)；夏晨、劉姝含、耿穎春、湯秀明、王琳、劉建娥參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byLIUJianxinandXIAChen. The manuscript was drafted and revised byXIAChen,LIUShuhan,GENGYinchun,TANGXiuming,WANGLin, andLIUJian′e. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.